本期為您推薦貴州大學(xué)生命科學(xué)院李祝教授課題組在基于微流控技術(shù)的高通量篩選方面相關(guān)的工作。該課題組通過液滴微流控平臺篩選拮抗菌，與傳統(tǒng)的瓊脂平板篩選方法相比，篩選效率提高了約3000倍。篩選得到的突變體，其抑菌活性較野生型菌株提高了62%。
圖1 拮抗菌的高通量篩選流程
軟腐病是一種嚴(yán)重影響農(nóng)作物的細(xì)菌性植物病害，主要由軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）引起，發(fā)生在蔬菜和觀賞植物的肉質(zhì)儲存組織中。這種病害可以迅速在植物體內(nèi)擴散，造成組織水解、腐爛，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至全軍覆沒，從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失，并成為限制農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物防治因具有生物防治效果好，無毒無害，無污染等特點越來越來受到人們的重視。農(nóng)用抗生素（生物活性物質(zhì)）、拮抗微生物等在病蟲害防治研究中得到了較好的應(yīng)用。傳統(tǒng)的拮抗菌篩選通常采用瓊脂平板法進行的分離和篩選，具有高勞動強度、高成本和低效率的限制因素，顯著影響拮抗菌的篩選和應(yīng)用。隨著液滴微流控技術(shù)的發(fā)展，利用其高通量的特性構(gòu)建新的篩選平臺—DREM Cell，顯著提高篩選效率的同時大幅降低了成本。
研究人員采集來自貴州省畢節(jié)市某魔芋種植區(qū)表面10 cm下的土壤樣本，分別采用液滴體系與培養(yǎng)皿體系進行微生物資源探查。鏡檢結(jié)果顯示含菌液滴數(shù)量約占總液滴數(shù)量的12.22%，液滴中菌落數(shù)與平板數(shù)量基本一致，表明菌株在液滴中的生長與平板培養(yǎng)具有相當(dāng)水平（圖2）。對不同培養(yǎng)條件下得到的菌落進行分析發(fā)現(xiàn)，液滴培養(yǎng)樣品中95%以上的OTU屬于稀有生物圈，其相對豐度在原始土壤樣品中低于0.01%（圖3），這表明液滴培養(yǎng)在揭示復(fù)雜微生物群落中罕見生物圈方面具有巨大潛力。
圖2 液滴生成和培養(yǎng)液滴樣品的顯微鏡圖像
圖3 不同培養(yǎng)樣品的擴增子測序結(jié)果比較
利用GFP-Ecc15菌株作為報告菌，拮抗菌可以抑制報告菌株的生長，從而顯著降低體系的熒光值（圖4，5）。在拮抗菌B. velezensis 和非拮抗菌E. coli 混合體系的富集篩選中驗證了篩選體系的適用性，建立拮抗菌的高通量篩選模型。拮抗菌的最大富集效率達(dá)到226倍，三次重復(fù)實驗拮抗菌的平均富集效率提高148倍。結(jié)果說明，基于液滴微流控的篩選模型能夠很好地將對報告菌株具有抑制作用的細(xì)菌分離出來。
圖4 GFP-Ecc15在液滴中的生長情況
圖5 拮抗菌與非拮抗菌對GFP-Ecc15熒光值的影響
最后基于該高通量模型，對土壤環(huán)境復(fù)雜樣本進行拮抗菌株的篩選。以每小時105個細(xì)胞速率進行分選，分選后的液滴涂布至平板，選取單菌落通過瓊脂擴散法驗證其對病原指示菌Ecc15的抑菌能力。經(jīng)過篩選，32株具有抗菌活性的細(xì)菌被富集，其中最佳菌株的抑菌直徑達(dá)到20.86±1.56 mm。經(jīng)過ARTP誘變，抑菌直徑進一步擴大至26.15±0.29 mm，顯著大于出發(fā)菌株的18.31±0.64 mm（圖6），抑菌活性提升62%。
圖6 高活性突變體與野生型抑菌圈差異
本研究將液滴微流控技術(shù)與ARTP誘變結(jié)合，利用DREM Cell平臺開展高通量拮抗菌篩選工作，進行環(huán)境微生物資源挖掘、復(fù)雜樣本拮抗菌株篩選以及菌株突變庫篩選工作。相較于傳統(tǒng)方法，培養(yǎng)基的試劑消耗降低至1.2×107分之一，篩選速率提升3000多倍，成功從土壤樣品中篩選并誘變得到高效的拮抗菌。該平臺為拮抗菌的篩選提供了一種更高效和成本更低的解決方案，為農(nóng)業(yè)生物防治提供了一個全新的視角，對于深入理解和利用隱藏于微小土壤顆粒中的生物資源有重要意義。
論文DOI：10.27047/d.cnki.ggudu.2023.001995
本期為您推薦貴州大學(xué)生命科學(xué)院李祝教授課題組在基于微流控技術(shù)的高通量篩選方面相關(guān)的工作。該課題組通過液滴微流控平臺篩選拮抗菌，與傳統(tǒng)的瓊脂平板篩選方法相比，篩選效率提高了約3000倍。篩選得到的突變體，其抑菌活性較野生型菌株提高了62%。
圖1 拮抗菌的高通量篩選流程
軟腐病是一種嚴(yán)重影響農(nóng)作物的細(xì)菌性植物病害，主要由軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）引起，發(fā)生在蔬菜和觀賞植物的肉質(zhì)儲存組織中。這種病害可以迅速在植物體內(nèi)擴散，造成組織水解、腐爛，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至全軍覆沒，從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失，并成為限制農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物防治因具有生物防治效果好，無毒無害，無污染等特點越來越來受到人們的重視。農(nóng)用抗生素（生物活性物質(zhì)）、拮抗微生物等在病蟲害防治研究中得到了較好的應(yīng)用。傳統(tǒng)的拮抗菌篩選通常采用瓊脂平板法進行的分離和篩選，具有高勞動強度、高成本和低效率的限制因素，顯著影響拮抗菌的篩選和應(yīng)用。隨著液滴微流控技術(shù)的發(fā)展，利用其高通量的特性構(gòu)建新的篩選平臺—DREM Cell，顯著提高篩選效率的同時大幅降低了成本。
研究人員采集來自貴州省畢節(jié)市某魔芋種植區(qū)表面10 cm下的土壤樣本，分別采用液滴體系與培養(yǎng)皿體系進行微生物資源探查。鏡檢結(jié)果顯示含菌液滴數(shù)量約占總液滴數(shù)量的12.22%，液滴中菌落數(shù)與平板數(shù)量基本一致，表明菌株在液滴中的生長與平板培養(yǎng)具有相當(dāng)水平（圖2）。對不同培養(yǎng)條件下得到的菌落進行分析發(fā)現(xiàn)，液滴培養(yǎng)樣品中95%以上的OTU屬于稀有生物圈，其相對豐度在原始土壤樣品中低于0.01%（圖3），這表明液滴培養(yǎng)在揭示復(fù)雜微生物群落中罕見生物圈方面具有巨大潛力。
圖2 液滴生成和培養(yǎng)液滴樣品的顯微鏡圖像
圖3 不同培養(yǎng)樣品的擴增子測序結(jié)果比較
利用GFP-Ecc15菌株作為報告菌，拮抗菌可以抑制報告菌株的生長，從而顯著降低體系的熒光值（圖4，5）。在拮抗菌B. velezensis 和非拮抗菌E. coli 混合體系的富集篩選中驗證了篩選體系的適用性，建立拮抗菌的高通量篩選模型。拮抗菌的最大富集效率達(dá)到226倍，三次重復(fù)實驗拮抗菌的平均富集效率提高148倍。結(jié)果說明，基于液滴微流控的篩選模型能夠很好地將對報告菌株具有抑制作用的細(xì)菌分離出來。
圖4 GFP-Ecc15在液滴中的生長情況
圖5 拮抗菌與非拮抗菌對GFP-Ecc15熒光值的影響
最后基于該高通量模型，對土壤環(huán)境復(fù)雜樣本進行拮抗菌株的篩選。以每小時105個細(xì)胞速率進行分選，分選后的液滴涂布至平板，選取單菌落通過瓊脂擴散法驗證其對病原指示菌Ecc15的抑菌能力。經(jīng)過篩選，32株具有抗菌活性的細(xì)菌被富集，其中最佳菌株的抑菌直徑達(dá)到20.86±1.56 mm。經(jīng)過ARTP誘變，抑菌直徑進一步擴大至26.15±0.29 mm，顯著大于出發(fā)菌株的18.31±0.64 mm（圖6），抑菌活性提升62%。
圖6 高活性突變體與野生型抑菌圈差異
本研究將液滴微流控技術(shù)與ARTP誘變結(jié)合，利用DREM Cell平臺開展高通量拮抗菌篩選工作，進行環(huán)境微生物資源挖掘、復(fù)雜樣本拮抗菌株篩選以及菌株突變庫篩選工作。相較于傳統(tǒng)方法，培養(yǎng)基的試劑消耗降低至1.2×107分之一，篩選速率提升3000多倍，成功從土壤樣品中篩選并誘變得到高效的拮抗菌。該平臺為拮抗菌的篩選提供了一種更高效和成本更低的解決方案，為農(nóng)業(yè)生物防治提供了一個全新的視角，對于深入理解和利用隱藏于微小土壤顆粒中的生物資源有重要意義。
論文DOI：10.27047/d.cnki.ggudu.2023.001995
