前言
土壤鹽堿化已成為與人類生產(chǎn)活動(dòng)相關(guān)的全球性問(wèn)題。在高鹽條件下，植物的光合作用、呼吸和離子運(yùn)輸?shù)却x活動(dòng)受到很大影響，導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)量下降甚至死亡。在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中，通常需要向反應(yīng)器中添加高濃度的糖或礦物質(zhì)，在此過(guò)程中微生物容易發(fā)生高滲脅迫，導(dǎo)致生長(zhǎng)和生產(chǎn)力降低。因此，如何提高生物體對(duì)惡劣環(huán)境的耐受性成為工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中的關(guān)鍵問(wèn)題。傳統(tǒng)微生物的適應(yīng)性進(jìn)化通常將微生物置于具有特殊條件的培養(yǎng)環(huán)境中（如特殊底物、高滲透壓、pH值等環(huán)境），依靠研究人員反復(fù)挑選生長(zhǎng)較快的微生物，但存在時(shí)效性差、工作量大的問(wèn)題，馴化效果往往也不盡人意。 天木生物全自動(dòng)微生物適應(yīng)性進(jìn)化儀（Automatic microbial adaptive evolution instrument，EVOL cell）是基于高氣體透過(guò)性微管路及單相微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)而成的微生物馴化裝備，具有微生物培養(yǎng)、傳代、化學(xué)因子梯度添加、實(shí)時(shí)檢測(cè)、氧分壓控制等功能，能夠應(yīng)用于多種微生物的培養(yǎng)和適應(yīng)性進(jìn)化。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
本案例使用天木生物全自動(dòng)微生物適應(yīng)性進(jìn)化儀為基礎(chǔ)開(kāi)展耐NaCl大腸桿菌的馴化實(shí)驗(yàn)?；罨蟮拇竽c桿菌按照2%的接種量接入新鮮培養(yǎng)基，并將其中8 mL接入耗材盒緩沖瓶。制備的無(wú)菌LB培養(yǎng)基（含1% NaCl）和高鹽LB培養(yǎng)基（含5% NaCl）用于EVOL cell根據(jù)傳代參數(shù)自動(dòng)調(diào)整NaCl的添加比例。本實(shí)驗(yàn)中NaCl設(shè)定為1%、1.3%、1.7%、2.0%、2.2%，2.4%，根據(jù)菌株生長(zhǎng)情況調(diào)整每個(gè)梯度傳代次數(shù)。定期觀察設(shè)備運(yùn)行情況，并且及時(shí)取樣進(jìn)行菌株性能驗(yàn)證及優(yōu)良菌株保藏。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
以1%NaCl作為菌株耐NaCl馴化的初始濃度，馴化總時(shí)長(zhǎng)280 h，全自動(dòng)完成傳代27次，在NaCl濃度達(dá)到2.4%時(shí)取出菌株，在搖瓶培養(yǎng)體系中比較馴化前后菌株對(duì)NaCl的耐受能力。原始菌株和耐受菌株分別在含2%和2.4%NaCl的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，結(jié)果如圖2B所示。經(jīng)過(guò)EVOL cell馴化后的菌株，在高NaCl濃度的培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)情況優(yōu)于原始菌株。在2%的搖瓶培養(yǎng)10 h后，原始菌株和耐受菌株OD值分別達(dá)到1.74和2.21，生長(zhǎng)性能提升27.01%。在2.4%的搖瓶培養(yǎng)10 h后，原始菌株和耐受菌株OD值分別達(dá)到1.43和2.09，生長(zhǎng)性能提升46.15%。
圖2 EVOL cell耐高NaCl大腸桿菌適應(yīng)性進(jìn)化結(jié)果。（A）大腸桿菌耐NaCl適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程；（B）原始菌株與耐受菌株在搖瓶中的生長(zhǎng)情況對(duì)比。
結(jié)論
本案例以大腸桿菌為研究對(duì)象，使用EVOL cell對(duì)其耐受NaCl性能進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，以提升該菌株在較高濃度NaCl環(huán)境脅迫下的生長(zhǎng)能力。經(jīng)過(guò)280 h 27輪的連續(xù)自動(dòng)傳代進(jìn)化，大腸桿菌在高NaCl濃度的培養(yǎng)基中具有穩(wěn)定的生長(zhǎng)性能，對(duì)NaCl的耐受能力提升27.01~46.15%，這說(shuō)明EVOL cell在菌種改良工作中的重要作用。全自動(dòng)的微生物適應(yīng)性進(jìn)化儀極大提升馴化工作的自動(dòng)化程度，減少實(shí)驗(yàn)中的人為操作失誤造成的誤差。實(shí)時(shí)檢測(cè)能力也有助于研究人員掌握菌株生長(zhǎng)情況，及時(shí)調(diào)整適應(yīng)性進(jìn)化策略，成為實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中微生物適應(yīng)性進(jìn)化培養(yǎng)的未來(lái)趨勢(shì)。
前言
土壤鹽堿化已成為與人類生產(chǎn)活動(dòng)相關(guān)的全球性問(wèn)題。在高鹽條件下，植物的光合作用、呼吸和離子運(yùn)輸?shù)却x活動(dòng)受到很大影響，導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)量下降甚至死亡。在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中，通常需要向反應(yīng)器中添加高濃度的糖或礦物質(zhì)，在此過(guò)程中微生物容易發(fā)生高滲脅迫，導(dǎo)致生長(zhǎng)和生產(chǎn)力降低。因此，如何提高生物體對(duì)惡劣環(huán)境的耐受性成為工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中的關(guān)鍵問(wèn)題。傳統(tǒng)微生物的適應(yīng)性進(jìn)化通常將微生物置于具有特殊條件的培養(yǎng)環(huán)境中（如特殊底物、高滲透壓、pH值等環(huán)境），依靠研究人員反復(fù)挑選生長(zhǎng)較快的微生物，但存在時(shí)效性差、工作量大的問(wèn)題，馴化效果往往也不盡人意。 天木生物全自動(dòng)微生物適應(yīng)性進(jìn)化儀（Automatic microbial adaptive evolution instrument，EVOL cell）是基于高氣體透過(guò)性微管路及單相微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)而成的微生物馴化裝備，具有微生物培養(yǎng)、傳代、化學(xué)因子梯度添加、實(shí)時(shí)檢測(cè)、氧分壓控制等功能，能夠應(yīng)用于多種微生物的培養(yǎng)和適應(yīng)性進(jìn)化。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
本案例使用天木生物全自動(dòng)微生物適應(yīng)性進(jìn)化儀為基礎(chǔ)開(kāi)展耐NaCl大腸桿菌的馴化實(shí)驗(yàn)?；罨蟮拇竽c桿菌按照2%的接種量接入新鮮培養(yǎng)基，并將其中8 mL接入耗材盒緩沖瓶。制備的無(wú)菌LB培養(yǎng)基（含1% NaCl）和高鹽LB培養(yǎng)基（含5% NaCl）用于EVOL cell根據(jù)傳代參數(shù)自動(dòng)調(diào)整NaCl的添加比例。本實(shí)驗(yàn)中NaCl設(shè)定為1%、1.3%、1.7%、2.0%、2.2%，2.4%，根據(jù)菌株生長(zhǎng)情況調(diào)整每個(gè)梯度傳代次數(shù)。定期觀察設(shè)備運(yùn)行情況，并且及時(shí)取樣進(jìn)行菌株性能驗(yàn)證及優(yōu)良菌株保藏。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
以1%NaCl作為菌株耐NaCl馴化的初始濃度，馴化總時(shí)長(zhǎng)280 h，全自動(dòng)完成傳代27次，在NaCl濃度達(dá)到2.4%時(shí)取出菌株，在搖瓶培養(yǎng)體系中比較馴化前后菌株對(duì)NaCl的耐受能力。原始菌株和耐受菌株分別在含2%和2.4%NaCl的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，結(jié)果如圖2B所示。經(jīng)過(guò)EVOL cell馴化后的菌株，在高NaCl濃度的培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)情況優(yōu)于原始菌株。在2%的搖瓶培養(yǎng)10 h后，原始菌株和耐受菌株OD值分別達(dá)到1.74和2.21，生長(zhǎng)性能提升27.01%。在2.4%的搖瓶培養(yǎng)10 h后，原始菌株和耐受菌株OD值分別達(dá)到1.43和2.09，生長(zhǎng)性能提升46.15%。
圖2 EVOL cell耐高NaCl大腸桿菌適應(yīng)性進(jìn)化結(jié)果。（A）大腸桿菌耐NaCl適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程；（B）原始菌株與耐受菌株在搖瓶中的生長(zhǎng)情況對(duì)比。
結(jié)論
本案例以大腸桿菌為研究對(duì)象，使用EVOL cell對(duì)其耐受NaCl性能進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，以提升該菌株在較高濃度NaCl環(huán)境脅迫下的生長(zhǎng)能力。經(jīng)過(guò)280 h 27輪的連續(xù)自動(dòng)傳代進(jìn)化，大腸桿菌在高NaCl濃度的培養(yǎng)基中具有穩(wěn)定的生長(zhǎng)性能，對(duì)NaCl的耐受能力提升27.01~46.15%，這說(shuō)明EVOL cell在菌種改良工作中的重要作用。全自動(dòng)的微生物適應(yīng)性進(jìn)化儀極大提升馴化工作的自動(dòng)化程度，減少實(shí)驗(yàn)中的人為操作失誤造成的誤差。實(shí)時(shí)檢測(cè)能力也有助于研究人員掌握菌株生長(zhǎng)情況，及時(shí)調(diào)整適應(yīng)性進(jìn)化策略，成為實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中微生物適應(yīng)性進(jìn)化培養(yǎng)的未來(lái)趨勢(shì)。
