本期為您推薦清華大學(xué)張翀教授團隊發(fā)表在Biochemical Engineering Journal上的一篇文章：Establishment of picodroplet-based co-culture system to improve erythritol production in Yarrowia lipolytica. 該研究基于液滴微流控篩選平臺（DREM cell），結(jié)合熒光激活液滴分選技術(shù)與基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器，建立了一種有效提高解脂耶氏酵母合成赤蘚糖醇的FADS-TF共培養(yǎng)流水線，可以完成對高產(chǎn)赤蘚糖醇的菌株的高通量篩選。
赤蘚糖醇是一種四碳多元醇，在食品工業(yè)中被廣泛用作低熱量的生物甜味劑。此外，人體內(nèi)血漿中的赤蘚糖醇水平升高可預(yù)測內(nèi)臟脂肪的增加和II型糖尿病的發(fā)展。目前，商業(yè)中所用的赤蘚糖醇主要通過溶脂亞羅菌中的磷酸戊糖途徑（PPP）生物合成。然而，由于對微生物的生物合成過程和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的細節(jié)尚未完全了解，因此對赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株進行合理的工程設(shè)計耗時又耗力。隨機誘變?yōu)榇笠?guī)模尋找目標遺傳性狀提供可能性，而由此產(chǎn)生的巨大的遺傳數(shù)據(jù)庫遠遠超過最先進的液體處理機器人的篩選能力。因此，迫切需要一種能夠支持菌株發(fā)育過程的高通量篩選方法。
熒光激活液滴分選（Fluorescence-activated droplet sorting ，F(xiàn)ADS）是高通量鑒定和分離具有優(yōu)良性狀稀有菌株的關(guān)鍵技術(shù)，近年來，基于FADS的方法已經(jīng)成功地篩選出高產(chǎn)分泌酶和小分子的菌株。同時基于轉(zhuǎn)錄因子（TF）的全細胞生物傳感器的開發(fā)為表征和篩選菌株提供更為強大工具。因此，液滴微流控技術(shù)在高效篩選高產(chǎn)赤蘚糖醇解脂耶氏酵母方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
在本研究中，研究團隊利用響應(yīng)赤蘚糖醇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，設(shè)計了一種新型生物傳感器，實時監(jiān)測赤蘚糖醇的濃度。結(jié)合FADS，構(gòu)建FADS-TF共表達體系（圖1），利用液滴微流控的超高通量篩選高產(chǎn)赤蘚糖醇的解脂耶氏酵母。該篩選流水線包括三個液滴操作步驟：酵母單細胞液滴的產(chǎn)生和孵育，微注入基于熒光的赤蘚糖醇生物傳感大腸桿菌，分選出熒光信號最高的1‰的液滴（圖2）?；谖⒁旱蔚墓ぷ髁鞒蹋瑢σ旱芜M行了兩階段的溫度和pH控制策略，以分離赤蘚糖醇的生產(chǎn)和檢測過程。然后利用pH敏感的紅霉素消除了生物傳感器的背景表達，最終建立了完整的共培養(yǎng)篩選系統(tǒng)（圖3）。
從第四輪突變文庫中成功篩選出最佳解脂耶氏酵母S4-9，經(jīng)114h發(fā)酵后，其赤蘚糖醇產(chǎn)量為231.2g/L。與野生型相比，在5L生物反應(yīng)器中，赤蘚糖醇產(chǎn)量和生產(chǎn)率分別提高了16.97%和26.09%（圖4）。這些結(jié)果表明，隨著額外的生物傳感器的出現(xiàn)，F(xiàn)ADS-TF在細胞外產(chǎn)物的高通量篩選方面具有巨大的潛力。
Fig. 1. The working mechanism of the biosensor for sensing erythritol.
Fig. 2. Erythritol transcription factor-based biosensor FADS platform for high-throughput screening.
Fig. 3. Establishment of the FADS-EryD platform.
Fig. 4. High-throughput screening for improved erythritol-producing strains.
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bej.2023.109036
本期為您推薦清華大學(xué)張翀教授團隊發(fā)表在Biochemical Engineering Journal上的一篇文章：Establishment of picodroplet-based co-culture system to improve erythritol production in Yarrowia lipolytica. 該研究基于液滴微流控篩選平臺（DREM cell），結(jié)合熒光激活液滴分選技術(shù)與基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器，建立了一種有效提高解脂耶氏酵母合成赤蘚糖醇的FADS-TF共培養(yǎng)流水線，可以完成對高產(chǎn)赤蘚糖醇的菌株的高通量篩選。
赤蘚糖醇是一種四碳多元醇，在食品工業(yè)中被廣泛用作低熱量的生物甜味劑。此外，人體內(nèi)血漿中的赤蘚糖醇水平升高可預(yù)測內(nèi)臟脂肪的增加和II型糖尿病的發(fā)展。目前，商業(yè)中所用的赤蘚糖醇主要通過溶脂亞羅菌中的磷酸戊糖途徑（PPP）生物合成。然而，由于對微生物的生物合成過程和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的細節(jié)尚未完全了解，因此對赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株進行合理的工程設(shè)計耗時又耗力。隨機誘變?yōu)榇笠?guī)模尋找目標遺傳性狀提供可能性，而由此產(chǎn)生的巨大的遺傳數(shù)據(jù)庫遠遠超過最先進的液體處理機器人的篩選能力。因此，迫切需要一種能夠支持菌株發(fā)育過程的高通量篩選方法。
熒光激活液滴分選（Fluorescence-activated droplet sorting ，F(xiàn)ADS）是高通量鑒定和分離具有優(yōu)良性狀稀有菌株的關(guān)鍵技術(shù)，近年來，基于FADS的方法已經(jīng)成功地篩選出高產(chǎn)分泌酶和小分子的菌株。同時基于轉(zhuǎn)錄因子（TF）的全細胞生物傳感器的開發(fā)為表征和篩選菌株提供更為強大工具。因此，液滴微流控技術(shù)在高效篩選高產(chǎn)赤蘚糖醇解脂耶氏酵母方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
在本研究中，研究團隊利用響應(yīng)赤蘚糖醇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，設(shè)計了一種新型生物傳感器，實時監(jiān)測赤蘚糖醇的濃度。結(jié)合FADS，構(gòu)建FADS-TF共表達體系（圖1），利用液滴微流控的超高通量篩選高產(chǎn)赤蘚糖醇的解脂耶氏酵母。該篩選流水線包括三個液滴操作步驟：酵母單細胞液滴的產(chǎn)生和孵育，微注入基于熒光的赤蘚糖醇生物傳感大腸桿菌，分選出熒光信號最高的1‰的液滴（圖2）?；谖⒁旱蔚墓ぷ髁鞒?，對液滴進行了兩階段的溫度和pH控制策略，以分離赤蘚糖醇的生產(chǎn)和檢測過程。然后利用pH敏感的紅霉素消除了生物傳感器的背景表達，最終建立了完整的共培養(yǎng)篩選系統(tǒng)（圖3）。
從第四輪突變文庫中成功篩選出最佳解脂耶氏酵母S4-9，經(jīng)114h發(fā)酵后，其赤蘚糖醇產(chǎn)量為231.2g/L。與野生型相比，在5L生物反應(yīng)器中，赤蘚糖醇產(chǎn)量和生產(chǎn)率分別提高了16.97%和26.09%（圖4）。這些結(jié)果表明，隨著額外的生物傳感器的出現(xiàn)，F(xiàn)ADS-TF在細胞外產(chǎn)物的高通量篩選方面具有巨大的潛力。
Fig. 1. The working mechanism of the biosensor for sensing erythritol.
Fig. 2. Erythritol transcription factor-based biosensor FADS platform for high-throughput screening.
Fig. 3. Establishment of the FADS-EryD platform.
Fig. 4. High-throughput screening for improved erythritol-producing strains.
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bej.2023.109036
