過程控制及設(shè)備
郭肖杰1,2，王立言3，張翀1,2,4，邢新會(huì)1,2,4,5
1 清華大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)系
2 工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
3 清華大學(xué) 無錫應(yīng)用技術(shù)研究院
4 清華大學(xué) 合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心
5 清華大學(xué) 深圳國際研究生院生物醫(yī)藥與健康工程研究院
摘要：液滴微流控由于可以快速生成大量微液滴，并實(shí)現(xiàn)單個(gè)液滴獨(dú)立的控制，每個(gè)液滴都可以作為獨(dú)立的單元進(jìn)行微生物培養(yǎng)，因此在微生物的高通量培養(yǎng)方面具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢。然而現(xiàn)有研究多停留在實(shí)驗(yàn)室搭建和使用階段，存在操作要求高、影響因素多、缺乏自動(dòng)化集成技術(shù)等關(guān)鍵問題，制約了液滴微流控技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用。文中以解決液滴微流控技術(shù)用于微生物培養(yǎng)的裝備化問題為目標(biāo)，系統(tǒng)研究了微流控各單元模塊的結(jié)構(gòu)與功能，通過對(duì)液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、檢測、分割、融合、分選等多種操作的開發(fā)與集成，成功研制出了小型一體化、全自動(dòng)高通量的微生物微液滴培養(yǎng) (Microbial Microdroplet Culture system，MMC) 裝備系統(tǒng)，可用于微生物的生長曲線測定、適應(yīng)性進(jìn)化、單因素多水平分析及代謝物檢測等，為面向微生物菌種高效選育的進(jìn)化培養(yǎng)和篩選提供了高通量儀器平臺(tái)。
微生物培養(yǎng)是微生物科學(xué)研究和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于微生物的分離、鑒定、分析、篩選、馴化、適應(yīng)性進(jìn)化、菌株改造等方面[1-3]。然而，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法主要以試管、搖瓶、固體平板為培養(yǎng)容器，輔以搖床、分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀等設(shè)備進(jìn)行微生物的培養(yǎng)、檢測和篩選，存在操作繁瑣、效率低、耗時(shí)、耗力、耗物等問題。近年發(fā)展起來的高通量培養(yǎng)手段主要是以微孔板為容器建立起來的培養(yǎng)篩選體系，但微孔板一方面溶氧水平低，混合效果差、蒸發(fā)效應(yīng)和熱效應(yīng)比較嚴(yán)重，常常導(dǎo)致菌種生長狀況差，且差異性大[1,4-6]；另一方面需要配套昂貴的設(shè)備，如移液工作站、酶標(biāo)儀等，才能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化培養(yǎng)和過程檢測。
液滴微流控作為微流控技術(shù)的重要分支，是近年來在傳統(tǒng)連續(xù)流微流控系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，利用互不相溶的兩液相產(chǎn)生分散的微液滴并對(duì)微液滴進(jìn)行操作的非連續(xù)流微流控技術(shù)[7]。微液滴具有體積小、比表面積大，獨(dú)立無交叉污染等特點(diǎn)，再結(jié)合液滴可控性強(qiáng)、通量高等優(yōu)勢，已經(jīng)有研究將其用于微生物的高通量培養(yǎng)[8]、馴化[9]、篩選[10-12]等方面，展現(xiàn)出重要的應(yīng)用潛力。然而，液滴微流控從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)走向應(yīng)用推廣仍然存在一系列關(guān)鍵問題。首先，液滴微流控操作繁瑣精細(xì)，技術(shù)要求和門檻高；其次，液滴微流控技術(shù)涉及光、機(jī)、電的元部件聯(lián)合使用，且需要和生物技術(shù)應(yīng)用場景結(jié)合，如果沒有多學(xué)科交叉協(xié)作，一般單個(gè)實(shí)驗(yàn)室或團(tuán)隊(duì)難以搭建高效的液滴微流控系統(tǒng)，從而無法開展液滴在微生物技術(shù)中的廣泛應(yīng)用研究；再次，由于液滴體積極小 (皮升–微升)，面向微生物傳代、進(jìn)化和分選的等基本操作的自動(dòng)化液滴精確操控與實(shí)時(shí)在線檢測實(shí)現(xiàn)難度大，難以形成一體化裝備系統(tǒng)[13]。為解決液滴微流控技術(shù)在微生物研究中應(yīng)用推廣的關(guān)鍵問題，筆者團(tuán)隊(duì)開展了一系列應(yīng)用基礎(chǔ)和工程轉(zhuǎn)化研究工作，成功地開發(fā)了一款基于液滴微流控技術(shù)的全自動(dòng)高通量微生物微液滴培養(yǎng)系統(tǒng) (Microbial microdroplet culture system，MMC)。該系統(tǒng)包含液滴識(shí)別模塊、液滴光譜檢測模塊、微流控芯片模塊、進(jìn)樣模塊等多個(gè)功能模塊，通過上述模塊的系統(tǒng)集成和控制，精確地建立了液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、監(jiān)測 (細(xì)胞光密度 (Optical density，OD) 和熒光)、分割、融合、分選等系列單元的自動(dòng)化操作體系，從而成功地實(shí)現(xiàn)了微生物液滴培養(yǎng)過程需要的接種、培養(yǎng)、監(jiān)測、傳代、篩選等功能的集成化。MMC系統(tǒng)中每個(gè)液滴體積為2–3 μL，可以容納高達(dá)200個(gè)液滴培養(yǎng)單元，相當(dāng)于200個(gè)搖瓶培養(yǎng)當(dāng)量。該微液滴培養(yǎng)體系能保證微生物生長過程中的無染菌性、溶氧、混合和質(zhì)能交換等需求，通過光譜檢測指標(biāo)對(duì)微液滴內(nèi)的微生物可進(jìn)行傳代、多梯度化學(xué)因子添加、提取等系列操作，滿足微生物研究的多種需求，比如生長曲線測定、適應(yīng)性進(jìn)化、單因素多水平分析、代謝物研究 (熒光檢測法) 等。
在液滴微流控系統(tǒng)中，對(duì)每個(gè)液滴的快速正確識(shí)別是對(duì)微液滴進(jìn)行精準(zhǔn)操作的前提。Jakiela等采用機(jī)器視覺方法，通過攝像機(jī)對(duì)芯片進(jìn)行圖像采集，利用其開發(fā)的“邊緣識(shí)別”算法，實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片內(nèi)微液滴的精確識(shí)別[9]。但該方法需要光源照明，會(huì)嚴(yán)重干擾本研究中的光譜信號(hào)檢測，同時(shí)所需配套設(shè)備較為昂貴復(fù)雜，不易實(shí)施，因此需要開發(fā)一種快速簡易的油水識(shí)別系統(tǒng)，并且不對(duì)光譜信號(hào)采集產(chǎn)生干擾。液滴微流控系統(tǒng)中的水相和油相均為無色透明液體 (水相可能會(huì)因?yàn)閮?nèi)容物的變化而出現(xiàn)顏色濁度的變化)，光吸收度幾乎相同，基于光吸收原理的普通的光電檢測系統(tǒng)則無法進(jìn)行精確識(shí)別?？紤]到油水兩相的光反射率和折射率不同，本研究提出并設(shè)計(jì)了如下的光電檢測系統(tǒng) (圖1)：激光以一定的角度斜射至芯片通道檢測窗口處，光電探測器置于芯片微通道下方，油相和水相流經(jīng)該檢測窗口處時(shí)，由于兩者的光反射率和折射率不同，造成光的反射和折射具有較大差異，因此進(jìn)入光電探測器的光強(qiáng)會(huì)產(chǎn)生較大變化，轉(zhuǎn)化輸出的電信號(hào)具有明顯特征，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)液滴的快速精確識(shí)別。
圖1 液滴識(shí)別系統(tǒng)示意圖
Fig. 1 Schematic diagram of droplet identification device.
微生物培養(yǎng)過程需要連續(xù)監(jiān)測微生物細(xì)胞濃度 (OD) 及底物和代謝產(chǎn)物的變化，以便深入研究其生長和代謝特性。MMC系統(tǒng)中液滴的體積小 (2–3 μL) ，并且全封閉運(yùn)行，無法取樣檢測，同時(shí)對(duì)于生長量較大的微生物更無法進(jìn)行稀釋處理。這就需要一個(gè)能夠?qū)崟r(shí)在線、大量程的光學(xué)檢測系統(tǒng)，且易于操作并具有經(jīng)濟(jì)性。已報(bào)道文獻(xiàn)多采用兩種方法進(jìn)行OD檢測，一種是將光纖集成于芯片之中，位于通道兩側(cè)，當(dāng)液滴經(jīng)過時(shí)進(jìn)行檢測[9]，這個(gè)方法對(duì)芯片工藝要求較高，芯片制造成本必然會(huì)大大增加。另一種方法則采用圖像采集，然后進(jìn)行灰度分析以獲取近似的OD數(shù)據(jù)[14]。但該方法難以對(duì)復(fù)雜的光譜信號(hào)進(jìn)行分段檢測，同時(shí)可檢測范圍有限，影響因素多。為解決上述問題，本研究在微流控芯片的實(shí)時(shí)在線檢測模塊開發(fā)中，設(shè)計(jì)了一種基于光纖的新型短光程光譜檢測系統(tǒng) (圖2)：該系統(tǒng)將光纖與芯片分離，置于芯片兩側(cè)，光纖與光源和檢測器連接，構(gòu)成光譜檢測通路，微液滴流經(jīng)芯片的檢測窗口處時(shí)，其光譜信號(hào)被檢測器讀取和轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換信號(hào)反饋給上位機(jī)進(jìn)行記錄和分析，并匹配到對(duì)應(yīng)編號(hào)的液滴中，然后顯示在控制軟件界面上。這種檢測方式操作簡單、實(shí)時(shí)在線檢測、穩(wěn)定性高，并且對(duì)芯片制造工藝要求較低，加工成本大幅度降低。
圖2 液滴光譜信號(hào)檢測示意圖
Fig. 2 Schematic diagram of droplet spectrum signal device.
在傳統(tǒng)微流控操作過程中，通常通過兩種方式將樣品引入至芯片。一種是利用注射泵和注射器，先用注射器抽取樣品，然后安裝至注射泵，通過注射泵推動(dòng)注射器將樣品導(dǎo)入芯片。這種進(jìn)樣方式需要對(duì)注射器以及注射泵閥頭進(jìn)行清洗和滅菌，在使用過程中反復(fù)拆裝，操作繁瑣，操作難度大，且染菌風(fēng)險(xiǎn)高[14]。另一種則是利用基于氣體介質(zhì)的壓力泵，先將樣品放置在密閉瓶子 中，通過壓力泵對(duì)瓶內(nèi)壓力的控制，將樣品泵入芯 片[9]。這種進(jìn)樣方式雖然簡單，但極易受系統(tǒng)壓力的波動(dòng)影響，無法精準(zhǔn)定量操作。MMC是面向微生物技術(shù)應(yīng)用開發(fā)的自動(dòng)化進(jìn)化培養(yǎng)裝備，上述兩種傳統(tǒng)操作方式均不能滿足本研究的需求，因此，如何開發(fā)出既能夠簡單精確導(dǎo)入樣品，又能夠便于清洗滅菌的進(jìn)樣系統(tǒng)成為MMC進(jìn)樣技術(shù)的關(guān)鍵所在。為此，本研究創(chuàng)造性地將傳統(tǒng)的兩種進(jìn)樣方式進(jìn)行了結(jié)合，既利用了注射泵進(jìn)樣的精確性，又利用了壓力泵進(jìn)樣的便捷性。本研究設(shè)計(jì)的MMC進(jìn)樣系統(tǒng)如圖3所示：該系統(tǒng)由油相、注射泵、進(jìn)樣瓶組成，其核心是進(jìn)樣瓶 的設(shè)計(jì)，進(jìn)樣瓶頂部有兩個(gè)管口，中間管口用于油相的進(jìn)出，側(cè)面管口則用于水相的進(jìn)出。注射泵通過頂部管口，推動(dòng)油相進(jìn)入進(jìn)樣瓶，因?yàn)?/span>MMC所用的油相密度低于水相，且油相和水相互不相溶，兩相在進(jìn)樣瓶中形成穩(wěn)定的分層狀態(tài)，進(jìn)而油相會(huì)驅(qū)動(dòng)等體積的水相從進(jìn)樣瓶的側(cè)面管口流出并進(jìn)入芯片，達(dá)到定量向芯片進(jìn)樣的目的。該設(shè)計(jì)可避免水相物質(zhì)流經(jīng)注射器、閥等裝置，無需清洗，操作簡便安全。同時(shí)該系統(tǒng)的組裝操作可在超凈臺(tái)中獨(dú)立完成，能夠有效地規(guī)避染菌風(fēng)險(xiǎn)，滿足后續(xù)微生物培養(yǎng)的需求。
圖3 進(jìn)樣系統(tǒng)設(shè)計(jì)示意圖
Fig. 3 Schematic diagram of sample injection system.
1.4.1 液滴發(fā)生
基于微流控芯片的液滴發(fā)生技術(shù)常見的有3種，分別為流動(dòng)聚焦法、十字通道法、T形通道法[13]，并且常常通過調(diào)節(jié)油相和水相的進(jìn)樣流速來控制生成液滴的大小。但由于芯片加工通常存在批次間誤差以及水相粘度差異等問題，不同芯片往往需要調(diào)整油相和水相的流速參數(shù)，才能形成穩(wěn)定的微液滴，這些問題一直是微流控芯片應(yīng)用于微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)。如何低成本地設(shè)計(jì)能夠兼容芯片批次間誤差和樣品粘度差異等實(shí)際情況，且可以高精度地對(duì)液滴進(jìn)行操作的芯片系統(tǒng)成為關(guān)鍵?？紤]到T形通道結(jié)構(gòu)簡單易加工、成本較低，本研究將該結(jié)構(gòu)引入芯片設(shè)計(jì)中。為了克服芯片批次誤差和樣品粘度差異等問題，本研究一反常規(guī)液滴微流控的連續(xù)進(jìn)樣方式，發(fā)明了獨(dú)特的油相和水相間歇順次驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣方法，進(jìn)而在芯片中生成體積大小精確可控的微液滴 (圖4A)，并通過巧妙串聯(lián)使用T形結(jié)構(gòu)通道，可以生成濃度梯度不同且精確可控的微液滴 (圖4B)。
1.4.2 液滴培養(yǎng)
微生物培養(yǎng)過程通常需要提供合適的溫度、氧氣等條件。基于微流控的好氧微生物培養(yǎng)，常常用透氣性良好的PDMS作為芯片材質(zhì)，輔以環(huán)境溫度控制，來滿足微生物的生長需求[15]。但是PDMS具有柔性較大、易形變等特點(diǎn)，給液滴的精確穩(wěn)定操作帶來了極大的負(fù)面影響，所以不適合用于本研究。因此，如何既能夠?qū)崿F(xiàn)液滴培養(yǎng)的氣體交換，又具備良好剛性和光學(xué)性能的芯片系統(tǒng)成為微生物微液滴培養(yǎng)的關(guān)鍵。而從目前已開發(fā)的芯片材質(zhì)分析，透氣性和剛性往往不可兼得。為此，本研究提出了將液滴操作和液滴培養(yǎng)兩個(gè)過程分離的思路，即利用剛性強(qiáng)、光學(xué)性能優(yōu)的材料加工微流控芯片，利用透氣性強(qiáng)、變形性小的微管路作為液滴培養(yǎng)的容器，實(shí)現(xiàn)硬質(zhì)芯片與透氣培養(yǎng)管路的有機(jī)結(jié)合，成功解決了微生物微液滴培養(yǎng)的難題。液滴在系統(tǒng)運(yùn)行過程中，不斷往復(fù)于培養(yǎng)管路之中，進(jìn)而充分滿足培養(yǎng)過程中氣體交換的需求。
圖4 液滴操作系統(tǒng)：(A：液滴發(fā)生；B：多濃度梯度液滴發(fā)生；C：液滴分割融合；D：液滴分選)
Fig. 4 Droplet operation system. (A) Droplet generation. (B) Droplet of multi-level concentration gradient generation. (C) Droplet spitting and fusion. (D) Droplet sorting.
1.4.3 液滴分割融合
微生物的傳代培養(yǎng)操作中，需要將培養(yǎng)到一定階段的菌懸液取出一部分，接種到新培養(yǎng)基中，繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在本研究需要實(shí)現(xiàn)將已培養(yǎng)的微生物微液滴向新培養(yǎng)基液滴中接種菌液，實(shí)現(xiàn)基于微液滴的微生物傳代培養(yǎng)操作。傳統(tǒng)的液滴分割融合方式常常利用芯片結(jié)構(gòu)對(duì)已培養(yǎng)的所有母液滴進(jìn)行分割，生成兩個(gè)子液滴，其中一個(gè)子液滴則直接從廢液口排出，待所有液滴完成分割后，再將所有待利用的子液滴與新培養(yǎng)基液滴進(jìn)行融合，從而完成液滴的微生物傳代[9]。但在對(duì)已培養(yǎng)的母液滴進(jìn)行分割處理中，往往存在液滴的識(shí)別和驅(qū)動(dòng)過程誤差，造成液滴切割融合的精確性下降，而長期多次操作會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致單次操作誤差的累積，造成最終的液滴體積差異過大，穩(wěn)定性差等問題。另外，如果分割后的子液滴體積較小，則其在往復(fù)運(yùn)動(dòng)過程中容易發(fā)生相互融合，影響系統(tǒng)穩(wěn)定性。如何能夠精確實(shí)現(xiàn)液滴分割融合操作、避免誤差累積、降低液滴之間融合風(fēng)險(xiǎn)、提高系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定性成為液滴傳代操作的關(guān)鍵。為解決液滴分割融合誤差的問題，本研究創(chuàng)造性地提出“掐頭去尾”式的液滴分割融合新方法 (圖4C)，即液滴經(jīng)過識(shí)別點(diǎn)時(shí)，液滴體積的大部分停留在注入通道中，通過推動(dòng)主通道中油相流動(dòng)，對(duì)駐留液滴暴露在主通道中的小部分頭部體積部分進(jìn)行切割，將液滴分割成兩部分，頭部液滴部分被推入廢液通道，另一部分則停留在駐留通道中；此時(shí)，將新培養(yǎng)基液滴推動(dòng)至液滴注入通道口處，然后將被切割液滴定量進(jìn)入新液滴，再次推動(dòng)融合后的液滴離開注入通道口，而殘余的液滴尾部則也被推入至廢液中。同時(shí)，這種巧妙的液滴操作方式，使得液滴的分割和融合過程緊密相連，避免了小體積液滴長時(shí)間運(yùn)行而可能造成的相互融合，極大提高了微液滴系統(tǒng)運(yùn)行的穩(wěn)定性。
1.4.4 液滴分選
液滴從生成開始，通過液滴識(shí)別系統(tǒng)對(duì)每個(gè)液滴進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)液滴的所有檢測數(shù)據(jù)都會(huì)與對(duì)應(yīng)編號(hào)的液滴進(jìn)行匹配，因此在分選操作實(shí)施前，液滴經(jīng)過識(shí)別點(diǎn)進(jìn)行編號(hào)識(shí)別，根據(jù)培養(yǎng)過程微液滴OD檢測數(shù)據(jù)，如果是所需液滴，就會(huì)通過閥口，收集至收集管中，如果是廢棄液滴則被推入下游管路，繼續(xù)下一個(gè)液滴的分選處理 (圖4D)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物微液滴的分選。
1.4.5 芯片集成化設(shè)計(jì)
在實(shí)現(xiàn)微液滴發(fā)生、培養(yǎng)、分割融合、監(jiān)測、分選的基礎(chǔ)之上，本研究對(duì)這些功能結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)集成，形成了功能完備的集成化微流控芯片系統(tǒng) (圖5)。其中2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)與進(jìn)樣瓶相連，分別用以盛放種子液、新鮮培養(yǎng)基、化學(xué)因子母液。1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)均是油相通道，直接與注射泵相連。1號(hào)、3號(hào)管路為長度為2 m的透氣性良好的AF-2400材質(zhì)管路 (內(nèi)徑=1 mm，外徑=1.6 mm)[16]，液滴在兩者之間進(jìn)行往復(fù)運(yùn)動(dòng)。廢液管與閥相連，用以排出廢液。芯片中的液滴識(shí)別點(diǎn)、光譜檢測點(diǎn)則分別作為液滴識(shí)別窗口和光譜檢測窗口。芯片系統(tǒng)整體置于恒溫控制倉中，保證微生物培養(yǎng)提供所需的最適溫度。
在上述各模塊功能基礎(chǔ)上，通過光機(jī)電一體化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，對(duì)各功能模塊進(jìn)行集成和控制系統(tǒng)開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了微生物微液滴的自動(dòng)發(fā)生、往復(fù)培養(yǎng)、在線監(jiān)測、分割、融合、分選等功能的有序操作，整機(jī)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖6所示：鹵素?zé)艉凸庾V儀作為光學(xué)檢測的功能元件，通過光纖連接至芯片檢測窗口處，對(duì)運(yùn)行中的液滴進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)采集和分析；閥和注射泵組協(xié)調(diào)聯(lián)動(dòng)，構(gòu)成整機(jī)動(dòng)力模塊；芯片系統(tǒng)和進(jìn)樣瓶均分布在操作倉中，并通過加熱片對(duì)其進(jìn)行恒溫控制；油相瓶和廢液瓶分別盛放油相試劑和廢液。
多部件的協(xié)調(diào)控制是實(shí)現(xiàn)裝備自動(dòng)化運(yùn)行的關(guān)鍵，本研究研制了用于MMC自動(dòng)化操作的軟件控制系統(tǒng) (圖7)。通過在金屬浴模塊、操作倉溫控模塊、液滴識(shí)別模塊中分別設(shè)置溫度傳感器1、溫度傳感器2、光電傳感器，可以將這些傳感器所采集數(shù)據(jù)通過底層通訊協(xié)議傳輸給基于行調(diào)ARM單片機(jī)開發(fā)的下位機(jī)控制系統(tǒng)。下位機(jī)系統(tǒng)將所收集的數(shù)據(jù)與上位機(jī)系統(tǒng)發(fā)送的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，然后對(duì)金屬浴模塊中的加熱器1、操作倉溫控模塊的加熱器2、液滴識(shí)別系統(tǒng)中的激光器進(jìn)控。泵閥組與光譜儀作為第三方元部件，其本身擁有自身的驅(qū)動(dòng)控制板，通過通訊協(xié)議，可直接接受上位機(jī)軟件的控制進(jìn)行精確工作。
圖5 集成化微流控芯片系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖
Fig. 5 Structure diagram of integrated microfluidic chip system.
圖6 集成化設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖
Fig. 6 Schematic diagram of integrated equipment structure.
圖7 MMC自動(dòng)化運(yùn)行控制系統(tǒng)框架圖
Fig. 7 MMC automatic control system frame.
MMC系統(tǒng)可以將液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、監(jiān)測、分割、融合、分選等復(fù)雜過程進(jìn)行自由組合，形成不同運(yùn)行邏輯，進(jìn)而適于多種多樣的微生物應(yīng)用研究。本研究基于MMC設(shè)備進(jìn)行了微生物的生長曲線測定、單因素多水平實(shí)驗(yàn)、適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)、代謝研究等多種應(yīng)用展示。
MMC所用的注射泵購于帝肯 (CavroXcalibur Pump)；電磁閥 (Mrv-01) 購于潤澤流體；鹵素光源 (HL2000) 和光譜儀 (EQ2000) 購于上海辰昶儀器設(shè)備有限公司；激光器購于華上激光科技有限公司；亞克力板和微管路 (AF-2400材質(zhì)) 均購于上海尚久橡塑制品廠；SMA905光纖購于深圳鑫瑞光技術(shù)有限公司；紫外-可見光分光光度計(jì) (721G型號(hào)) 購于上海儀電分析儀器有限公司；臺(tái)式恒溫?fù)u床 (THZ-D) 購于蘇州碩舟科技有限公司。
實(shí)驗(yàn)中所用菌種為大腸桿菌Escherichia coli MG1655，含綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 表達(dá)質(zhì)粒；所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基 (成分：蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，氯化鈉0.5 g，加水50 mL)；礦物油 (含表面活性劑span 80，濃度為10 g/L) 購自Sigma-Aldrich；單硫酸卡那霉素 (獸用) 購自山東魯西獸藥。
大腸桿菌種子液制備：從平板上挑取大腸桿菌E. coli MG1655菌落接種至LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min搖床條件下活化培養(yǎng)3–4 h。
大腸桿菌在MMC中培養(yǎng)過程：取大腸桿菌種子液，按照5%的接種量接種至含5 mL培養(yǎng)基的15 mL離心管中混勻，然后轉(zhuǎn)移至MMC進(jìn)樣瓶中進(jìn)行上機(jī)實(shí)驗(yàn)，MMC中培養(yǎng)溫度設(shè)定為37 ℃，根據(jù)不同的需求和條件，設(shè)定MMC的軟件系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。
大腸桿菌分光光度計(jì)檢測方法：取大腸桿菌懸液稀釋至OD600在0.2–0.8之間，使用分光光度計(jì)測定OD600值，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算原始樣品OD600值。
將波長為620 nm的半導(dǎo)體激光器照射在液滴識(shí)別窗口處，入射角從0°逐漸增大至接近90°，觀察液滴和油相經(jīng)過檢測窗口處時(shí)光電壓值大小 (圖8A)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)入射角為36°時(shí)，液滴經(jīng)過檢測窗口的光電壓信號(hào)值可以穩(wěn)定大于3 V，而此時(shí)油相的光電壓信號(hào)值則穩(wěn)定小于0.6 V (圖8B)，據(jù)此可以將油相和液滴進(jìn)行精確的區(qū)分，每個(gè)液滴的識(shí)別時(shí)間小于0.3 s，從而實(shí)現(xiàn)了液滴的快速精確識(shí)別。且該系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、運(yùn)行穩(wěn)定、易批量化搭建。
芯片檢測窗口處通道深度為1 mm，所以對(duì)應(yīng)的光吸收度檢測光程約為1 mm，這區(qū)別于常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)比色皿所使用的1 cm光程，由于測量光程的大幅度減小，OD的線性范圍和可檢測量程得到了大幅度提高。通過對(duì)大腸桿菌的離心處理，獲得高濃度的菌懸液，將該懸液進(jìn)行梯度稀釋，并同時(shí)用傳統(tǒng)的紫外-可見光分光光度計(jì)和MMC的OD直接檢測系統(tǒng) (無稀釋) 進(jìn)行比較測試 (圖9)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MMC的OD直接檢測量程達(dá)到30，檢測靈敏度為0.05，此外，MMC直接測得的OD值與基于稀釋法的分光光度計(jì)檢測OD值在0–20之間成良好的線性關(guān)系。并且與傳統(tǒng)的OD檢測方式的頻繁取樣和稀釋操作相比，MMC具有無需取樣、無需稀釋、實(shí)時(shí)在線檢測等多種顯著優(yōu)勢，有利于實(shí)現(xiàn)MMC的自動(dòng)化操作。
圖8 液滴識(shí)別系統(tǒng) (A：裝置實(shí)物圖；B：液滴和油相的電壓信號(hào)值)
Fig. 8 Droplet identification system on chip. (A) Image of chip for detection. (B) Detected signal of droplet and oil.
圖9 液滴光譜檢測 (A：液滴光譜信號(hào)檢測裝置圖；B：MMC和分光光度計(jì)的中OD600檢測數(shù)據(jù)對(duì)比)
Fig. 9 Droplet spectral detection. (A) Photo of droplet OD measurement set. (B) Calibration curves for OD measured by UV-VIS-spectrometer and MMC detection.
進(jìn)樣瓶是向芯片穩(wěn)定精確進(jìn)樣、無菌控制的關(guān)鍵。由于進(jìn)樣瓶的原理是等體積的油驅(qū)動(dòng)等體積的水相樣品進(jìn)入芯片，因此進(jìn)樣瓶內(nèi)不允許有氣泡存在，否則由于氣泡的可壓縮性過大，會(huì)嚴(yán)重影響進(jìn)樣的精確性。為了保證進(jìn)樣瓶裝樣時(shí)空氣的完全排除，無氣泡殘留，本研究將瓶帽設(shè)計(jì)于瓶子底部，而進(jìn)樣瓶內(nèi)頂部則采用圓弧形設(shè)計(jì)，便于瓶內(nèi)氣泡的充分排出 (圖10)。在操作過程中，我們首先在超凈臺(tái)內(nèi)將樣品加入到瓶子中，并補(bǔ)充油相至瓶子完全充滿，由于密度不同，在瓶子中油相位于上層而水相位于下層，裝完樣品后，將進(jìn)樣瓶中間的油相出入口接口插入側(cè)邊的水相出入口中，形成密封，防止轉(zhuǎn)移過程中造成樣品污染，從超凈臺(tái)拿出后，將其與芯片和儀器進(jìn)行連接，水相出口 (Sample outlet) 與芯片連接，油相入口 (Oil inlet) 與MMC儀器接口連接，通過注射泵推動(dòng)油相即可實(shí)現(xiàn)定量驅(qū)動(dòng)水相進(jìn)入芯片。這種方式不僅避免了樣品染菌風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)操作簡便、極易清洗滅菌，大大提高了儀器的操作簡便性。
圖10 進(jìn)入芯片形成液滴的進(jìn)樣瓶實(shí)物照片
Fig. 10 Photo of sample bottle flowing into chip to make droplets.
經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)測試，本研究最終選用聚甲基丙烯酸甲酯 (Polymeric methyl methacrylate, PMMA) 材質(zhì)進(jìn)行芯片加工，該材質(zhì)具有光學(xué)性能好、易加工鍵合、剛性較好等特點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)芯片通道深度和寬度均為1 mm (圖11A) 。與芯片連接的管路采用AF-2400材質(zhì)，該管路透氣性好，可以滿足多數(shù)微生物的氣體交換 (圖11B) 。液滴的生成、切割融合、分選、檢測均在芯片中進(jìn)行，而液滴的培養(yǎng)則是在管路中進(jìn)行。油相和水相樣品一端通過管路與芯片連通，另一端則與注射泵連通。芯片上分布有液滴操作的相關(guān)流道以及用于液滴識(shí)別和檢測的窗口。
通過對(duì)MMC系統(tǒng)各個(gè)功能模塊的光機(jī)電結(jié)構(gòu)一體化設(shè)計(jì)及集成，最終形成了商業(yè)化應(yīng)用設(shè)備 (圖12A)。MMC系統(tǒng)操作倉室內(nèi)部采用恒溫控制，芯片和樣品均放置在操作倉中。油相試劑放置在油相試劑倉室，運(yùn)行過程中產(chǎn)生的廢液則排放至放置在廢液瓶倉室的廢液瓶中。MMC儀器下側(cè)的注射泵倉室中放置儀器所使用的6臺(tái)工業(yè)注射泵。在恒溫操作倉室內(nèi)部 (圖12B)，紫外燈為倉室進(jìn)行照射滅菌處理，進(jìn)樣瓶放置于金屬浴中，可以快速升溫并保持穩(wěn)定，避免瓶子熱脹冷縮對(duì)進(jìn)樣精度造成的影響，為方便液滴收集，設(shè)計(jì)EP管支架于倉室內(nèi)。
圖11 芯片系統(tǒng)實(shí)物圖 (A：MMC微流控芯片實(shí)物圖；B：MMC培養(yǎng)管路實(shí)物圖)
Fig. 11 Photo of microfluidic chip system. (A) MMC microfluidic chip. (B) MMC culture tube.
圖12 MMC實(shí)物圖 (A：MMC外觀；B：恒溫倉室內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖)
Fig. 12 Photo of MMC. (A) The exterior of MMC. (B) Internal image of temperature control space in MMC.
在本項(xiàng)目所研制的MMC裝備上，本研究分別進(jìn)行了大腸桿菌的生長曲線測定、適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)、單因素多水平實(shí)驗(yàn)以及微生物代謝水平檢測實(shí)驗(yàn)。在這些實(shí)驗(yàn)中，均采用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌作為種子液，以5%接種量接種至進(jìn)樣瓶中，設(shè)置OD檢測波長為600 nm。各實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同需求設(shè)置不同的液滴生成數(shù)量，每輪實(shí)驗(yàn)開始前，均需要對(duì)設(shè)備及芯片進(jìn)行初始化運(yùn)行，然后開始進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。
3.6.1 生長曲線測定
生長曲線測定實(shí)驗(yàn)是研究微生物生長狀況的基本實(shí)驗(yàn)。在設(shè)備初始化完成后，選取軟件中“生長曲線測定”功能，設(shè)置液滴數(shù)量為20，點(diǎn)擊“運(yùn)行”，28 h后導(dǎo)出液滴培養(yǎng)數(shù)據(jù)并進(jìn)行處理。本研究對(duì)20個(gè)液滴的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析，繪制出大腸桿菌的生長曲線，結(jié)果如圖13A 所示：生長曲線程“S”形，且20個(gè)液滴生長一致性良好，各液滴之間的OD值變異系數(shù)小于5%，充分說明了該設(shè)備良好的微生物培養(yǎng)和檢測性能。
3.6.2 適應(yīng)性進(jìn)化研究
在在微生物的適應(yīng)性進(jìn)化研究中，常常需要在對(duì)微生物進(jìn)行持續(xù)傳代的過程中，逐漸提高耐受因子的濃度。本實(shí)驗(yàn)中，以氯化鈉作為耐受因子，選取MMC操作軟件中“適應(yīng)性進(jìn)化”模塊，設(shè)置液滴數(shù)目為30，每傳代3次，將氯化鈉 (NaCl) 濃度提高到一個(gè)新的水平，持續(xù)傳代馴化，獲得的進(jìn)化培養(yǎng)結(jié)果如圖13B所示：圖中具有周期性的峰形曲線代表微生物的每一代生長曲線，而峰谷則代表在該時(shí)間點(diǎn)處進(jìn)行了微生物的傳代操作，OD值會(huì)驟然下降，紅色折線則代表對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間下液滴培養(yǎng)單元中的鹽濃度，其梯度濃度由小到大依次為11 g/L、11.5 g/L、12 g/L、12.5 g/L，每個(gè)濃度梯度下進(jìn)行3次大腸桿菌的連續(xù)傳代培養(yǎng) (共20 h)，然后提升到更高的濃度梯度繼續(xù)傳代馴化。該馴化過程共進(jìn)行80 h，隨著鹽濃度的逐漸提升，大腸桿菌的生長速率和OD最大值逐漸下降，但每批傳代液滴里的微生物均能生長，并且隨著進(jìn)化進(jìn)行，液滴間OD逐漸呈現(xiàn)出差異變化。該實(shí)驗(yàn)過程充分體現(xiàn)了適應(yīng)性進(jìn)化的基本實(shí)驗(yàn)策略，即在長期的傳代培養(yǎng)過程中，通過逐漸提高耐受性因子水平，以進(jìn)化出菌種的耐受性。由于MMC的液滴培養(yǎng)單元僅為2 μL，試劑消耗量極少，而進(jìn)樣瓶可以一次性盛放12 mL的樣品，因此單次上機(jī)操作能夠滿足多達(dá)150次的連續(xù)傳代培養(yǎng)。同時(shí)，如圖13B所示，MMC中的每個(gè)液滴代表獨(dú)立進(jìn)化培養(yǎng)單元，MMC的在線檢測功能可以為微生物進(jìn)化培養(yǎng)過程提供海量數(shù)據(jù)，因此結(jié)合MMC的底物和代謝產(chǎn)物檢測功能及后續(xù)多組學(xué)分析方法，能夠?qū)ξ⑸镞M(jìn)化過程進(jìn)行系統(tǒng)深入的分析。
3.6.3 單因素多水平實(shí)驗(yàn)
單因素多水平實(shí)驗(yàn)是在常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)中，用以測定某個(gè)化學(xué)因子對(duì)微生物生長狀態(tài)的影響。本實(shí)驗(yàn)中以單硫酸卡那霉素作為化學(xué)因子，研究其對(duì)大腸桿菌生長的影響。樣品上機(jī)后，選 取軟件中“單因素多水平功能”，設(shè)置參數(shù)為：梯 度個(gè)數(shù)8，每個(gè)梯度平行單元 (液滴) 數(shù)10個(gè)，啟動(dòng)設(shè)備運(yùn)行功能即可。結(jié)果如圖13C所示：圖中不同顏色曲線代表不同的單硫酸卡納霉素培養(yǎng)條件下大腸桿菌生長情況，每條曲線都是根據(jù)在單個(gè)梯度下，對(duì)10個(gè)平行微液滴單元的OD檢測值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理得到的結(jié)果。從圖中可以看出，隨著單硫酸卡納霉素的濃度增加，大腸桿菌的生長受抑制情況越來越嚴(yán)重。相對(duì)于傳統(tǒng)在線檢測設(shè)備，MMC的OD檢測線性范圍寬 (0–20)，可以將微生物生長過程完整地記錄下來，能夠更加便捷地研究化學(xué)因子對(duì)菌種生長的影響規(guī)律。
圖13 MMC在大腸桿菌培養(yǎng)中的應(yīng)用 (A：生長曲線測定；B：以氯化鈉為進(jìn)化壓力的菌株適應(yīng)性進(jìn)化；C：單硫酸卡那霉素對(duì)大腸桿菌生長的單因素多水平影響實(shí)驗(yàn)；D：MMC中菌株代謝檢測 (GFP熒光檢測))
Fig. 13 Use of MMC in E. coli culture. (A) Growth curve test. (B) Adaptive laboratory evolution experiment using NaCl as the selective pressure. (C) Single-factor experiment for bacterial growth with addition of kanamycin monosulfate at different concentrations. (D) Online monitoring of bacterial metabolism in terms of GFP fluorescence during the cell growth in MMC.
3.6.4 微生物代謝水平研究
微生物代謝水平?？梢酝ㄟ^熒光信號(hào)來檢測表征，本研究利用的大腸桿菌含有GFP基因，其熒光信號(hào)強(qiáng)度變化可反映微生物的代謝狀態(tài)變化。選取MMC軟件中“熒光檢測”功能模塊，設(shè)置熒光激發(fā)與檢測波段為 (485ex/528em，即激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長528 nm)，液滴數(shù)目為10，結(jié)果如圖13D所示。圖中的黑色曲線代表大腸桿菌OD值變化，綠色曲線是GFP熒光值變化。從圖13D可以看出，隨著大腸桿菌的生長，其GFP熒光信號(hào)強(qiáng)度也在逐漸增加，表明GFP的合成與細(xì)胞生長偶聯(lián)，而培養(yǎng)到達(dá)平臺(tái)期后，GFP熒光強(qiáng)度基本保持不變，表明蛋白合成結(jié)束。MMC這種在線快速檢測熒光的方式，結(jié)合微生物生長曲線的在線檢測和進(jìn)化培養(yǎng)及分選功能等，對(duì)于能夠合成自身具有熒光的代謝產(chǎn)物的微生物及以熒光蛋白作為分子標(biāo)記的基因工程菌的代謝特性研究具有平臺(tái)支撐作用。
除了上述4種典型的微生物實(shí)驗(yàn)和微生物篩選外，MMC還可以根據(jù)使用者的自身需求，支持自定義編程多種功能，設(shè)置不同的液滴操作流程，以滿足各種實(shí)驗(yàn)需要[17]。同時(shí)，已有的研究結(jié)果也表明，MMC可應(yīng)用于多種微生物的培養(yǎng)研究，表現(xiàn)出明顯優(yōu)于孔板的應(yīng)用成效，具有廣譜適用性[18]。
液滴微流控技術(shù)因生成的液滴體積小、通量高、質(zhì)能交換快、可獨(dú)立操作等特性為微生物研究提供了新方法，但其操作要求高、影響因素多、缺乏自動(dòng)化集成等問題限制了該技術(shù)的應(yīng)用推廣。本研究針對(duì)上述關(guān)鍵難題，通過設(shè)計(jì)開發(fā)液滴識(shí)別功能模塊、液滴檢測模塊、進(jìn)樣模塊以及芯片模塊等，將液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、檢測、分割、融合、分選等多種復(fù)雜操作進(jìn)行有機(jī)集成，成功研制出了一款全自動(dòng)高通量微生物微液滴培養(yǎng)系統(tǒng) (MMC)，形成了小型化、自動(dòng)化、高通量的微生物培養(yǎng)系統(tǒng)，并且操作簡單，運(yùn)行穩(wěn)定。相比于傳統(tǒng)的微生物高通量培養(yǎng)裝備，MMC具有物料消耗少、操作簡單、在線檢測 (OD和熒光)、數(shù)據(jù)采集密度大、普適性強(qiáng)等多種優(yōu)勢。
目前，本研究已經(jīng)完成了MMC系統(tǒng)底層單元操作的開發(fā)，未來需要針對(duì)微生物研究的不同需求，進(jìn)一步豐富MMC系統(tǒng)應(yīng)用功能，例如開發(fā)多因素多水平正交實(shí)驗(yàn)功能，多樣品自動(dòng)進(jìn)樣技術(shù)用以同時(shí)測定多個(gè)菌種的生長曲線，液滴內(nèi)氧分壓和pH等參數(shù)的精確控制等，全面助推微生物培養(yǎng)進(jìn)入高通量智能化的微滴時(shí)代。
通訊作者1
主持國家自然科學(xué)基金重大儀器專項(xiàng)項(xiàng)目、中以國際合作項(xiàng)目。發(fā)表學(xué)術(shù)論文280余篇，合作著書8本，編寫英文專著1部，譯著教材2部。申請(qǐng)發(fā)明專利100余項(xiàng)，獲得發(fā)明專利80余項(xiàng)。擔(dān)任Biochemical Engineering Journal副主編及《生物工程學(xué)報(bào)》等多個(gè)國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊編委。獲得第17屆全國發(fā)明展覽會(huì)獎(jiǎng)銀獎(jiǎng) (2007)、北京市科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)三等獎(jiǎng) (2008)、中國石油和化學(xué)工業(yè)協(xié)會(huì)技術(shù)發(fā)明獎(jiǎng)二等獎(jiǎng) (2009)、中國僑界貢獻(xiàn)獎(jiǎng) (創(chuàng)新人才) (2010)、高等學(xué)?？茖W(xué)研究優(yōu)秀成果獎(jiǎng) (科學(xué)技術(shù)) 科技進(jìn)步獎(jiǎng) 二等獎(jiǎng) (2015年)、 第45屆日內(nèi)瓦國際發(fā)明展金獎(jiǎng) (2017)、中國化工學(xué)會(huì)系統(tǒng)2012–2017年度先進(jìn)個(gè)人 (2017)、全國歸僑僑眷先進(jìn)個(gè)人 (2018)、日本東京大學(xué)工學(xué)院會(huì)士 (Fellow) 榮譽(yù)稱號(hào) (2018) 中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)技術(shù)發(fā)明一等獎(jiǎng) (2019)。
通訊作者2
主持國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題。在Nature Chemical Biology、Nucleic Acids Research、Metabolic Engineering等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表多篇論文。擔(dān)任中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)微生物育種分會(huì)秘書長、Carbon Resources、Food Science and Human Wellness等期刊編委。獲得中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)技術(shù)發(fā)明一等獎(jiǎng) (2019)、“長江學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”青年學(xué)者 (2018)、“倫世儀教育基金”杰出青年學(xué)者獎(jiǎng) (2018)、第45屆日內(nèi)瓦國際發(fā)明展金獎(jiǎng) (2017)。
·END·
過程控制及設(shè)備
郭肖杰1,2，王立言3，張翀1,2,4，邢新會(huì)1,2,4,5
1 清華大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)系
2 工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
3 清華大學(xué) 無錫應(yīng)用技術(shù)研究院
4 清華大學(xué) 合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心
5 清華大學(xué) 深圳國際研究生院生物醫(yī)藥與健康工程研究院
摘要：液滴微流控由于可以快速生成大量微液滴，并實(shí)現(xiàn)單個(gè)液滴獨(dú)立的控制，每個(gè)液滴都可以作為獨(dú)立的單元進(jìn)行微生物培養(yǎng)，因此在微生物的高通量培養(yǎng)方面具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢。然而現(xiàn)有研究多停留在實(shí)驗(yàn)室搭建和使用階段，存在操作要求高、影響因素多、缺乏自動(dòng)化集成技術(shù)等關(guān)鍵問題，制約了液滴微流控技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用。文中以解決液滴微流控技術(shù)用于微生物培養(yǎng)的裝備化問題為目標(biāo)，系統(tǒng)研究了微流控各單元模塊的結(jié)構(gòu)與功能，通過對(duì)液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、檢測、分割、融合、分選等多種操作的開發(fā)與集成，成功研制出了小型一體化、全自動(dòng)高通量的微生物微液滴培養(yǎng) (Microbial Microdroplet Culture system，MMC) 裝備系統(tǒng)，可用于微生物的生長曲線測定、適應(yīng)性進(jìn)化、單因素多水平分析及代謝物檢測等，為面向微生物菌種高效選育的進(jìn)化培養(yǎng)和篩選提供了高通量儀器平臺(tái)。
微生物培養(yǎng)是微生物科學(xué)研究和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于微生物的分離、鑒定、分析、篩選、馴化、適應(yīng)性進(jìn)化、菌株改造等方面[1-3]。然而，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法主要以試管、搖瓶、固體平板為培養(yǎng)容器，輔以搖床、分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀等設(shè)備進(jìn)行微生物的培養(yǎng)、檢測和篩選，存在操作繁瑣、效率低、耗時(shí)、耗力、耗物等問題。近年發(fā)展起來的高通量培養(yǎng)手段主要是以微孔板為容器建立起來的培養(yǎng)篩選體系，但微孔板一方面溶氧水平低，混合效果差、蒸發(fā)效應(yīng)和熱效應(yīng)比較嚴(yán)重，常常導(dǎo)致菌種生長狀況差，且差異性大[1,4-6]；另一方面需要配套昂貴的設(shè)備，如移液工作站、酶標(biāo)儀等，才能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化培養(yǎng)和過程檢測。
液滴微流控作為微流控技術(shù)的重要分支，是近年來在傳統(tǒng)連續(xù)流微流控系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，利用互不相溶的兩液相產(chǎn)生分散的微液滴并對(duì)微液滴進(jìn)行操作的非連續(xù)流微流控技術(shù)[7]。微液滴具有體積小、比表面積大，獨(dú)立無交叉污染等特點(diǎn)，再結(jié)合液滴可控性強(qiáng)、通量高等優(yōu)勢，已經(jīng)有研究將其用于微生物的高通量培養(yǎng)[8]、馴化[9]、篩選[10-12]等方面，展現(xiàn)出重要的應(yīng)用潛力。然而，液滴微流控從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)走向應(yīng)用推廣仍然存在一系列關(guān)鍵問題。首先，液滴微流控操作繁瑣精細(xì)，技術(shù)要求和門檻高；其次，液滴微流控技術(shù)涉及光、機(jī)、電的元部件聯(lián)合使用，且需要和生物技術(shù)應(yīng)用場景結(jié)合，如果沒有多學(xué)科交叉協(xié)作，一般單個(gè)實(shí)驗(yàn)室或團(tuán)隊(duì)難以搭建高效的液滴微流控系統(tǒng)，從而無法開展液滴在微生物技術(shù)中的廣泛應(yīng)用研究；再次，由于液滴體積極小 (皮升–微升)，面向微生物傳代、進(jìn)化和分選的等基本操作的自動(dòng)化液滴精確操控與實(shí)時(shí)在線檢測實(shí)現(xiàn)難度大，難以形成一體化裝備系統(tǒng)[13]。為解決液滴微流控技術(shù)在微生物研究中應(yīng)用推廣的關(guān)鍵問題，筆者團(tuán)隊(duì)開展了一系列應(yīng)用基礎(chǔ)和工程轉(zhuǎn)化研究工作，成功地開發(fā)了一款基于液滴微流控技術(shù)的全自動(dòng)高通量微生物微液滴培養(yǎng)系統(tǒng) (Microbial microdroplet culture system，MMC)。該系統(tǒng)包含液滴識(shí)別模塊、液滴光譜檢測模塊、微流控芯片模塊、進(jìn)樣模塊等多個(gè)功能模塊，通過上述模塊的系統(tǒng)集成和控制，精確地建立了液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、監(jiān)測 (細(xì)胞光密度 (Optical density，OD) 和熒光)、分割、融合、分選等系列單元的自動(dòng)化操作體系，從而成功地實(shí)現(xiàn)了微生物液滴培養(yǎng)過程需要的接種、培養(yǎng)、監(jiān)測、傳代、篩選等功能的集成化。MMC系統(tǒng)中每個(gè)液滴體積為2–3 μL，可以容納高達(dá)200個(gè)液滴培養(yǎng)單元，相當(dāng)于200個(gè)搖瓶培養(yǎng)當(dāng)量。該微液滴培養(yǎng)體系能保證微生物生長過程中的無染菌性、溶氧、混合和質(zhì)能交換等需求，通過光譜檢測指標(biāo)對(duì)微液滴內(nèi)的微生物可進(jìn)行傳代、多梯度化學(xué)因子添加、提取等系列操作，滿足微生物研究的多種需求，比如生長曲線測定、適應(yīng)性進(jìn)化、單因素多水平分析、代謝物研究 (熒光檢測法) 等。
在液滴微流控系統(tǒng)中，對(duì)每個(gè)液滴的快速正確識(shí)別是對(duì)微液滴進(jìn)行精準(zhǔn)操作的前提。Jakiela等采用機(jī)器視覺方法，通過攝像機(jī)對(duì)芯片進(jìn)行圖像采集，利用其開發(fā)的“邊緣識(shí)別”算法，實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片內(nèi)微液滴的精確識(shí)別[9]。但該方法需要光源照明，會(huì)嚴(yán)重干擾本研究中的光譜信號(hào)檢測，同時(shí)所需配套設(shè)備較為昂貴復(fù)雜，不易實(shí)施，因此需要開發(fā)一種快速簡易的油水識(shí)別系統(tǒng)，并且不對(duì)光譜信號(hào)采集產(chǎn)生干擾。液滴微流控系統(tǒng)中的水相和油相均為無色透明液體 (水相可能會(huì)因?yàn)閮?nèi)容物的變化而出現(xiàn)顏色濁度的變化)，光吸收度幾乎相同，基于光吸收原理的普通的光電檢測系統(tǒng)則無法進(jìn)行精確識(shí)別?？紤]到油水兩相的光反射率和折射率不同，本研究提出并設(shè)計(jì)了如下的光電檢測系統(tǒng) (圖1)：激光以一定的角度斜射至芯片通道檢測窗口處，光電探測器置于芯片微通道下方，油相和水相流經(jīng)該檢測窗口處時(shí)，由于兩者的光反射率和折射率不同，造成光的反射和折射具有較大差異，因此進(jìn)入光電探測器的光強(qiáng)會(huì)產(chǎn)生較大變化，轉(zhuǎn)化輸出的電信號(hào)具有明顯特征，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)液滴的快速精確識(shí)別。
圖1 液滴識(shí)別系統(tǒng)示意圖
Fig. 1 Schematic diagram of droplet identification device.
微生物培養(yǎng)過程需要連續(xù)監(jiān)測微生物細(xì)胞濃度 (OD) 及底物和代謝產(chǎn)物的變化，以便深入研究其生長和代謝特性。MMC系統(tǒng)中液滴的體積小 (2–3 μL) ，并且全封閉運(yùn)行，無法取樣檢測，同時(shí)對(duì)于生長量較大的微生物更無法進(jìn)行稀釋處理。這就需要一個(gè)能夠?qū)崟r(shí)在線、大量程的光學(xué)檢測系統(tǒng)，且易于操作并具有經(jīng)濟(jì)性。已報(bào)道文獻(xiàn)多采用兩種方法進(jìn)行OD檢測，一種是將光纖集成于芯片之中，位于通道兩側(cè)，當(dāng)液滴經(jīng)過時(shí)進(jìn)行檢測[9]，這個(gè)方法對(duì)芯片工藝要求較高，芯片制造成本必然會(huì)大大增加。另一種方法則采用圖像采集，然后進(jìn)行灰度分析以獲取近似的OD數(shù)據(jù)[14]。但該方法難以對(duì)復(fù)雜的光譜信號(hào)進(jìn)行分段檢測，同時(shí)可檢測范圍有限，影響因素多。為解決上述問題，本研究在微流控芯片的實(shí)時(shí)在線檢測模塊開發(fā)中，設(shè)計(jì)了一種基于光纖的新型短光程光譜檢測系統(tǒng) (圖2)：該系統(tǒng)將光纖與芯片分離，置于芯片兩側(cè)，光纖與光源和檢測器連接，構(gòu)成光譜檢測通路，微液滴流經(jīng)芯片的檢測窗口處時(shí)，其光譜信號(hào)被檢測器讀取和轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換信號(hào)反饋給上位機(jī)進(jìn)行記錄和分析，并匹配到對(duì)應(yīng)編號(hào)的液滴中，然后顯示在控制軟件界面上。這種檢測方式操作簡單、實(shí)時(shí)在線檢測、穩(wěn)定性高，并且對(duì)芯片制造工藝要求較低，加工成本大幅度降低。
圖2 液滴光譜信號(hào)檢測示意圖
Fig. 2 Schematic diagram of droplet spectrum signal device.
在傳統(tǒng)微流控操作過程中，通常通過兩種方式將樣品引入至芯片。一種是利用注射泵和注射器，先用注射器抽取樣品，然后安裝至注射泵，通過注射泵推動(dòng)注射器將樣品導(dǎo)入芯片。這種進(jìn)樣方式需要對(duì)注射器以及注射泵閥頭進(jìn)行清洗和滅菌，在使用過程中反復(fù)拆裝，操作繁瑣，操作難度大，且染菌風(fēng)險(xiǎn)高[14]。另一種則是利用基于氣體介質(zhì)的壓力泵，先將樣品放置在密閉瓶子 中，通過壓力泵對(duì)瓶內(nèi)壓力的控制，將樣品泵入芯 片[9]。這種進(jìn)樣方式雖然簡單，但極易受系統(tǒng)壓力的波動(dòng)影響，無法精準(zhǔn)定量操作。MMC是面向微生物技術(shù)應(yīng)用開發(fā)的自動(dòng)化進(jìn)化培養(yǎng)裝備，上述兩種傳統(tǒng)操作方式均不能滿足本研究的需求，因此，如何開發(fā)出既能夠簡單精確導(dǎo)入樣品，又能夠便于清洗滅菌的進(jìn)樣系統(tǒng)成為MMC進(jìn)樣技術(shù)的關(guān)鍵所在。為此，本研究創(chuàng)造性地將傳統(tǒng)的兩種進(jìn)樣方式進(jìn)行了結(jié)合，既利用了注射泵進(jìn)樣的精確性，又利用了壓力泵進(jìn)樣的便捷性。本研究設(shè)計(jì)的MMC進(jìn)樣系統(tǒng)如圖3所示：該系統(tǒng)由油相、注射泵、進(jìn)樣瓶組成，其核心是進(jìn)樣瓶 的設(shè)計(jì)，進(jìn)樣瓶頂部有兩個(gè)管口，中間管口用于油相的進(jìn)出，側(cè)面管口則用于水相的進(jìn)出。注射泵通過頂部管口，推動(dòng)油相進(jìn)入進(jìn)樣瓶，因?yàn)?/span>MMC所用的油相密度低于水相，且油相和水相互不相溶，兩相在進(jìn)樣瓶中形成穩(wěn)定的分層狀態(tài)，進(jìn)而油相會(huì)驅(qū)動(dòng)等體積的水相從進(jìn)樣瓶的側(cè)面管口流出并進(jìn)入芯片，達(dá)到定量向芯片進(jìn)樣的目的。該設(shè)計(jì)可避免水相物質(zhì)流經(jīng)注射器、閥等裝置，無需清洗，操作簡便安全。同時(shí)該系統(tǒng)的組裝操作可在超凈臺(tái)中獨(dú)立完成，能夠有效地規(guī)避染菌風(fēng)險(xiǎn)，滿足后續(xù)微生物培養(yǎng)的需求。
圖3 進(jìn)樣系統(tǒng)設(shè)計(jì)示意圖
Fig. 3 Schematic diagram of sample injection system.
1.4.1 液滴發(fā)生
基于微流控芯片的液滴發(fā)生技術(shù)常見的有3種，分別為流動(dòng)聚焦法、十字通道法、T形通道法[13]，并且常常通過調(diào)節(jié)油相和水相的進(jìn)樣流速來控制生成液滴的大小。但由于芯片加工通常存在批次間誤差以及水相粘度差異等問題，不同芯片往往需要調(diào)整油相和水相的流速參數(shù)，才能形成穩(wěn)定的微液滴，這些問題一直是微流控芯片應(yīng)用于微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)。如何低成本地設(shè)計(jì)能夠兼容芯片批次間誤差和樣品粘度差異等實(shí)際情況，且可以高精度地對(duì)液滴進(jìn)行操作的芯片系統(tǒng)成為關(guān)鍵?？紤]到T形通道結(jié)構(gòu)簡單易加工、成本較低，本研究將該結(jié)構(gòu)引入芯片設(shè)計(jì)中。為了克服芯片批次誤差和樣品粘度差異等問題，本研究一反常規(guī)液滴微流控的連續(xù)進(jìn)樣方式，發(fā)明了獨(dú)特的油相和水相間歇順次驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣方法，進(jìn)而在芯片中生成體積大小精確可控的微液滴 (圖4A)，并通過巧妙串聯(lián)使用T形結(jié)構(gòu)通道，可以生成濃度梯度不同且精確可控的微液滴 (圖4B)。
1.4.2 液滴培養(yǎng)
微生物培養(yǎng)過程通常需要提供合適的溫度、氧氣等條件?；谖⒘骺氐暮醚跷⑸锱囵B(yǎng)，常常用透氣性良好的PDMS作為芯片材質(zhì)，輔以環(huán)境溫度控制，來滿足微生物的生長需求[15]。但是PDMS具有柔性較大、易形變等特點(diǎn)，給液滴的精確穩(wěn)定操作帶來了極大的負(fù)面影響，所以不適合用于本研究。因此，如何既能夠?qū)崿F(xiàn)液滴培養(yǎng)的氣體交換，又具備良好剛性和光學(xué)性能的芯片系統(tǒng)成為微生物微液滴培養(yǎng)的關(guān)鍵。而從目前已開發(fā)的芯片材質(zhì)分析，透氣性和剛性往往不可兼得。為此，本研究提出了將液滴操作和液滴培養(yǎng)兩個(gè)過程分離的思路，即利用剛性強(qiáng)、光學(xué)性能優(yōu)的材料加工微流控芯片，利用透氣性強(qiáng)、變形性小的微管路作為液滴培養(yǎng)的容器，實(shí)現(xiàn)硬質(zhì)芯片與透氣培養(yǎng)管路的有機(jī)結(jié)合，成功解決了微生物微液滴培養(yǎng)的難題。液滴在系統(tǒng)運(yùn)行過程中，不斷往復(fù)于培養(yǎng)管路之中，進(jìn)而充分滿足培養(yǎng)過程中氣體交換的需求。
圖4 液滴操作系統(tǒng)：(A：液滴發(fā)生；B：多濃度梯度液滴發(fā)生；C：液滴分割融合；D：液滴分選)
Fig. 4 Droplet operation system. (A) Droplet generation. (B) Droplet of multi-level concentration gradient generation. (C) Droplet spitting and fusion. (D) Droplet sorting.
1.4.3 液滴分割融合
微生物的傳代培養(yǎng)操作中，需要將培養(yǎng)到一定階段的菌懸液取出一部分，接種到新培養(yǎng)基中，繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在本研究需要實(shí)現(xiàn)將已培養(yǎng)的微生物微液滴向新培養(yǎng)基液滴中接種菌液，實(shí)現(xiàn)基于微液滴的微生物傳代培養(yǎng)操作。傳統(tǒng)的液滴分割融合方式常常利用芯片結(jié)構(gòu)對(duì)已培養(yǎng)的所有母液滴進(jìn)行分割，生成兩個(gè)子液滴，其中一個(gè)子液滴則直接從廢液口排出，待所有液滴完成分割后，再將所有待利用的子液滴與新培養(yǎng)基液滴進(jìn)行融合，從而完成液滴的微生物傳代[9]。但在對(duì)已培養(yǎng)的母液滴進(jìn)行分割處理中，往往存在液滴的識(shí)別和驅(qū)動(dòng)過程誤差，造成液滴切割融合的精確性下降，而長期多次操作會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致單次操作誤差的累積，造成最終的液滴體積差異過大，穩(wěn)定性差等問題。另外，如果分割后的子液滴體積較小，則其在往復(fù)運(yùn)動(dòng)過程中容易發(fā)生相互融合，影響系統(tǒng)穩(wěn)定性。如何能夠精確實(shí)現(xiàn)液滴分割融合操作、避免誤差累積、降低液滴之間融合風(fēng)險(xiǎn)、提高系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定性成為液滴傳代操作的關(guān)鍵。為解決液滴分割融合誤差的問題，本研究創(chuàng)造性地提出“掐頭去尾”式的液滴分割融合新方法 (圖4C)，即液滴經(jīng)過識(shí)別點(diǎn)時(shí)，液滴體積的大部分停留在注入通道中，通過推動(dòng)主通道中油相流動(dòng)，對(duì)駐留液滴暴露在主通道中的小部分頭部體積部分進(jìn)行切割，將液滴分割成兩部分，頭部液滴部分被推入廢液通道，另一部分則停留在駐留通道中；此時(shí)，將新培養(yǎng)基液滴推動(dòng)至液滴注入通道口處，然后將被切割液滴定量進(jìn)入新液滴，再次推動(dòng)融合后的液滴離開注入通道口，而殘余的液滴尾部則也被推入至廢液中。同時(shí)，這種巧妙的液滴操作方式，使得液滴的分割和融合過程緊密相連，避免了小體積液滴長時(shí)間運(yùn)行而可能造成的相互融合，極大提高了微液滴系統(tǒng)運(yùn)行的穩(wěn)定性。
1.4.4 液滴分選
液滴從生成開始，通過液滴識(shí)別系統(tǒng)對(duì)每個(gè)液滴進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)液滴的所有檢測數(shù)據(jù)都會(huì)與對(duì)應(yīng)編號(hào)的液滴進(jìn)行匹配，因此在分選操作實(shí)施前，液滴經(jīng)過識(shí)別點(diǎn)進(jìn)行編號(hào)識(shí)別，根據(jù)培養(yǎng)過程微液滴OD檢測數(shù)據(jù)，如果是所需液滴，就會(huì)通過閥口，收集至收集管中，如果是廢棄液滴則被推入下游管路，繼續(xù)下一個(gè)液滴的分選處理 (圖4D)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)微生物微液滴的分選。
1.4.5 芯片集成化設(shè)計(jì)
在實(shí)現(xiàn)微液滴發(fā)生、培養(yǎng)、分割融合、監(jiān)測、分選的基礎(chǔ)之上，本研究對(duì)這些功能結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)集成，形成了功能完備的集成化微流控芯片系統(tǒng) (圖5)。其中2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)與進(jìn)樣瓶相連，分別用以盛放種子液、新鮮培養(yǎng)基、化學(xué)因子母液。1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)均是油相通道，直接與注射泵相連。1號(hào)、3號(hào)管路為長度為2 m的透氣性良好的AF-2400材質(zhì)管路 (內(nèi)徑=1 mm，外徑=1.6 mm)[16]，液滴在兩者之間進(jìn)行往復(fù)運(yùn)動(dòng)。廢液管與閥相連，用以排出廢液。芯片中的液滴識(shí)別點(diǎn)、光譜檢測點(diǎn)則分別作為液滴識(shí)別窗口和光譜檢測窗口。芯片系統(tǒng)整體置于恒溫控制倉中，保證微生物培養(yǎng)提供所需的最適溫度。
在上述各模塊功能基礎(chǔ)上，通過光機(jī)電一體化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，對(duì)各功能模塊進(jìn)行集成和控制系統(tǒng)開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了微生物微液滴的自動(dòng)發(fā)生、往復(fù)培養(yǎng)、在線監(jiān)測、分割、融合、分選等功能的有序操作，整機(jī)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖6所示：鹵素?zé)艉凸庾V儀作為光學(xué)檢測的功能元件，通過光纖連接至芯片檢測窗口處，對(duì)運(yùn)行中的液滴進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)采集和分析；閥和注射泵組協(xié)調(diào)聯(lián)動(dòng)，構(gòu)成整機(jī)動(dòng)力模塊；芯片系統(tǒng)和進(jìn)樣瓶均分布在操作倉中，并通過加熱片對(duì)其進(jìn)行恒溫控制；油相瓶和廢液瓶分別盛放油相試劑和廢液。
多部件的協(xié)調(diào)控制是實(shí)現(xiàn)裝備自動(dòng)化運(yùn)行的關(guān)鍵，本研究研制了用于MMC自動(dòng)化操作的軟件控制系統(tǒng) (圖7)。通過在金屬浴模塊、操作倉溫控模塊、液滴識(shí)別模塊中分別設(shè)置溫度傳感器1、溫度傳感器2、光電傳感器，可以將這些傳感器所采集數(shù)據(jù)通過底層通訊協(xié)議傳輸給基于行調(diào)ARM單片機(jī)開發(fā)的下位機(jī)控制系統(tǒng)。下位機(jī)系統(tǒng)將所收集的數(shù)據(jù)與上位機(jī)系統(tǒng)發(fā)送的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，然后對(duì)金屬浴模塊中的加熱器1、操作倉溫控模塊的加熱器2、液滴識(shí)別系統(tǒng)中的激光器進(jìn)控。泵閥組與光譜儀作為第三方元部件，其本身擁有自身的驅(qū)動(dòng)控制板，通過通訊協(xié)議，可直接接受上位機(jī)軟件的控制進(jìn)行精確工作。
圖5 集成化微流控芯片系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖
Fig. 5 Structure diagram of integrated microfluidic chip system.
圖6 集成化設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖
Fig. 6 Schematic diagram of integrated equipment structure.
圖7 MMC自動(dòng)化運(yùn)行控制系統(tǒng)框架圖
Fig. 7 MMC automatic control system frame.
MMC系統(tǒng)可以將液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、監(jiān)測、分割、融合、分選等復(fù)雜過程進(jìn)行自由組合，形成不同運(yùn)行邏輯，進(jìn)而適于多種多樣的微生物應(yīng)用研究。本研究基于MMC設(shè)備進(jìn)行了微生物的生長曲線測定、單因素多水平實(shí)驗(yàn)、適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)、代謝研究等多種應(yīng)用展示。
MMC所用的注射泵購于帝肯 (CavroXcalibur Pump)；電磁閥 (Mrv-01) 購于潤澤流體；鹵素光源 (HL2000) 和光譜儀 (EQ2000) 購于上海辰昶儀器設(shè)備有限公司；激光器購于華上激光科技有限公司；亞克力板和微管路 (AF-2400材質(zhì)) 均購于上海尚久橡塑制品廠；SMA905光纖購于深圳鑫瑞光技術(shù)有限公司；紫外-可見光分光光度計(jì) (721G型號(hào)) 購于上海儀電分析儀器有限公司；臺(tái)式恒溫?fù)u床 (THZ-D) 購于蘇州碩舟科技有限公司。
實(shí)驗(yàn)中所用菌種為大腸桿菌Escherichia coli MG1655，含綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 表達(dá)質(zhì)粒；所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基 (成分：蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，氯化鈉0.5 g，加水50 mL)；礦物油 (含表面活性劑span 80，濃度為10 g/L) 購自Sigma-Aldrich；單硫酸卡那霉素 (獸用) 購自山東魯西獸藥。
大腸桿菌種子液制備：從平板上挑取大腸桿菌E. coli MG1655菌落接種至LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min搖床條件下活化培養(yǎng)3–4 h。
大腸桿菌在MMC中培養(yǎng)過程：取大腸桿菌種子液，按照5%的接種量接種至含5 mL培養(yǎng)基的15 mL離心管中混勻，然后轉(zhuǎn)移至MMC進(jìn)樣瓶中進(jìn)行上機(jī)實(shí)驗(yàn)，MMC中培養(yǎng)溫度設(shè)定為37 ℃，根據(jù)不同的需求和條件，設(shè)定MMC的軟件系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。
大腸桿菌分光光度計(jì)檢測方法：取大腸桿菌懸液稀釋至OD600在0.2–0.8之間，使用分光光度計(jì)測定OD600值，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算原始樣品OD600值。
將波長為620 nm的半導(dǎo)體激光器照射在液滴識(shí)別窗口處，入射角從0°逐漸增大至接近90°，觀察液滴和油相經(jīng)過檢測窗口處時(shí)光電壓值大小 (圖8A)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)入射角為36°時(shí)，液滴經(jīng)過檢測窗口的光電壓信號(hào)值可以穩(wěn)定大于3 V，而此時(shí)油相的光電壓信號(hào)值則穩(wěn)定小于0.6 V (圖8B)，據(jù)此可以將油相和液滴進(jìn)行精確的區(qū)分，每個(gè)液滴的識(shí)別時(shí)間小于0.3 s，從而實(shí)現(xiàn)了液滴的快速精確識(shí)別。且該系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、運(yùn)行穩(wěn)定、易批量化搭建。
芯片檢測窗口處通道深度為1 mm，所以對(duì)應(yīng)的光吸收度檢測光程約為1 mm，這區(qū)別于常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)比色皿所使用的1 cm光程，由于測量光程的大幅度減小，OD的線性范圍和可檢測量程得到了大幅度提高。通過對(duì)大腸桿菌的離心處理，獲得高濃度的菌懸液，將該懸液進(jìn)行梯度稀釋，并同時(shí)用傳統(tǒng)的紫外-可見光分光光度計(jì)和MMC的OD直接檢測系統(tǒng) (無稀釋) 進(jìn)行比較測試 (圖9)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MMC的OD直接檢測量程達(dá)到30，檢測靈敏度為0.05，此外，MMC直接測得的OD值與基于稀釋法的分光光度計(jì)檢測OD值在0–20之間成良好的線性關(guān)系。并且與傳統(tǒng)的OD檢測方式的頻繁取樣和稀釋操作相比，MMC具有無需取樣、無需稀釋、實(shí)時(shí)在線檢測等多種顯著優(yōu)勢，有利于實(shí)現(xiàn)MMC的自動(dòng)化操作。
圖8 液滴識(shí)別系統(tǒng) (A：裝置實(shí)物圖；B：液滴和油相的電壓信號(hào)值)
Fig. 8 Droplet identification system on chip. (A) Image of chip for detection. (B) Detected signal of droplet and oil.
圖9 液滴光譜檢測 (A：液滴光譜信號(hào)檢測裝置圖；B：MMC和分光光度計(jì)的中OD600檢測數(shù)據(jù)對(duì)比)
Fig. 9 Droplet spectral detection. (A) Photo of droplet OD measurement set. (B) Calibration curves for OD measured by UV-VIS-spectrometer and MMC detection.
進(jìn)樣瓶是向芯片穩(wěn)定精確進(jìn)樣、無菌控制的關(guān)鍵。由于進(jìn)樣瓶的原理是等體積的油驅(qū)動(dòng)等體積的水相樣品進(jìn)入芯片，因此進(jìn)樣瓶內(nèi)不允許有氣泡存在，否則由于氣泡的可壓縮性過大，會(huì)嚴(yán)重影響進(jìn)樣的精確性。為了保證進(jìn)樣瓶裝樣時(shí)空氣的完全排除，無氣泡殘留，本研究將瓶帽設(shè)計(jì)于瓶子底部，而進(jìn)樣瓶內(nèi)頂部則采用圓弧形設(shè)計(jì)，便于瓶內(nèi)氣泡的充分排出 (圖10)。在操作過程中，我們首先在超凈臺(tái)內(nèi)將樣品加入到瓶子中，并補(bǔ)充油相至瓶子完全充滿，由于密度不同，在瓶子中油相位于上層而水相位于下層，裝完樣品后，將進(jìn)樣瓶中間的油相出入口接口插入側(cè)邊的水相出入口中，形成密封，防止轉(zhuǎn)移過程中造成樣品污染，從超凈臺(tái)拿出后，將其與芯片和儀器進(jìn)行連接，水相出口 (Sample outlet) 與芯片連接，油相入口 (Oil inlet) 與MMC儀器接口連接，通過注射泵推動(dòng)油相即可實(shí)現(xiàn)定量驅(qū)動(dòng)水相進(jìn)入芯片。這種方式不僅避免了樣品染菌風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)操作簡便、極易清洗滅菌，大大提高了儀器的操作簡便性。
圖10 進(jìn)入芯片形成液滴的進(jìn)樣瓶實(shí)物照片
Fig. 10 Photo of sample bottle flowing into chip to make droplets.
經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)測試，本研究最終選用聚甲基丙烯酸甲酯 (Polymeric methyl methacrylate, PMMA) 材質(zhì)進(jìn)行芯片加工，該材質(zhì)具有光學(xué)性能好、易加工鍵合、剛性較好等特點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)芯片通道深度和寬度均為1 mm (圖11A) 。與芯片連接的管路采用AF-2400材質(zhì)，該管路透氣性好，可以滿足多數(shù)微生物的氣體交換 (圖11B) 。液滴的生成、切割融合、分選、檢測均在芯片中進(jìn)行，而液滴的培養(yǎng)則是在管路中進(jìn)行。油相和水相樣品一端通過管路與芯片連通，另一端則與注射泵連通。芯片上分布有液滴操作的相關(guān)流道以及用于液滴識(shí)別和檢測的窗口。
通過對(duì)MMC系統(tǒng)各個(gè)功能模塊的光機(jī)電結(jié)構(gòu)一體化設(shè)計(jì)及集成，最終形成了商業(yè)化應(yīng)用設(shè)備 (圖12A)。MMC系統(tǒng)操作倉室內(nèi)部采用恒溫控制，芯片和樣品均放置在操作倉中。油相試劑放置在油相試劑倉室，運(yùn)行過程中產(chǎn)生的廢液則排放至放置在廢液瓶倉室的廢液瓶中。MMC儀器下側(cè)的注射泵倉室中放置儀器所使用的6臺(tái)工業(yè)注射泵。在恒溫操作倉室內(nèi)部 (圖12B)，紫外燈為倉室進(jìn)行照射滅菌處理，進(jìn)樣瓶放置于金屬浴中，可以快速升溫并保持穩(wěn)定，避免瓶子熱脹冷縮對(duì)進(jìn)樣精度造成的影響，為方便液滴收集，設(shè)計(jì)EP管支架于倉室內(nèi)。
圖11 芯片系統(tǒng)實(shí)物圖 (A：MMC微流控芯片實(shí)物圖；B：MMC培養(yǎng)管路實(shí)物圖)
Fig. 11 Photo of microfluidic chip system. (A) MMC microfluidic chip. (B) MMC culture tube.
圖12 MMC實(shí)物圖 (A：MMC外觀；B：恒溫倉室內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖)
Fig. 12 Photo of MMC. (A) The exterior of MMC. (B) Internal image of temperature control space in MMC.
在本項(xiàng)目所研制的MMC裝備上，本研究分別進(jìn)行了大腸桿菌的生長曲線測定、適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)、單因素多水平實(shí)驗(yàn)以及微生物代謝水平檢測實(shí)驗(yàn)。在這些實(shí)驗(yàn)中，均采用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌作為種子液，以5%接種量接種至進(jìn)樣瓶中，設(shè)置OD檢測波長為600 nm。各實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同需求設(shè)置不同的液滴生成數(shù)量，每輪實(shí)驗(yàn)開始前，均需要對(duì)設(shè)備及芯片進(jìn)行初始化運(yùn)行，然后開始進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。
3.6.1 生長曲線測定
生長曲線測定實(shí)驗(yàn)是研究微生物生長狀況的基本實(shí)驗(yàn)。在設(shè)備初始化完成后，選取軟件中“生長曲線測定”功能，設(shè)置液滴數(shù)量為20，點(diǎn)擊“運(yùn)行”，28 h后導(dǎo)出液滴培養(yǎng)數(shù)據(jù)并進(jìn)行處理。本研究對(duì)20個(gè)液滴的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分析，繪制出大腸桿菌的生長曲線，結(jié)果如圖13A 所示：生長曲線程“S”形，且20個(gè)液滴生長一致性良好，各液滴之間的OD值變異系數(shù)小于5%，充分說明了該設(shè)備良好的微生物培養(yǎng)和檢測性能。
3.6.2 適應(yīng)性進(jìn)化研究
在在微生物的適應(yīng)性進(jìn)化研究中，常常需要在對(duì)微生物進(jìn)行持續(xù)傳代的過程中，逐漸提高耐受因子的濃度。本實(shí)驗(yàn)中，以氯化鈉作為耐受因子，選取MMC操作軟件中“適應(yīng)性進(jìn)化”模塊，設(shè)置液滴數(shù)目為30，每傳代3次，將氯化鈉 (NaCl) 濃度提高到一個(gè)新的水平，持續(xù)傳代馴化，獲得的進(jìn)化培養(yǎng)結(jié)果如圖13B所示：圖中具有周期性的峰形曲線代表微生物的每一代生長曲線，而峰谷則代表在該時(shí)間點(diǎn)處進(jìn)行了微生物的傳代操作，OD值會(huì)驟然下降，紅色折線則代表對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間下液滴培養(yǎng)單元中的鹽濃度，其梯度濃度由小到大依次為11 g/L、11.5 g/L、12 g/L、12.5 g/L，每個(gè)濃度梯度下進(jìn)行3次大腸桿菌的連續(xù)傳代培養(yǎng) (共20 h)，然后提升到更高的濃度梯度繼續(xù)傳代馴化。該馴化過程共進(jìn)行80 h，隨著鹽濃度的逐漸提升，大腸桿菌的生長速率和OD最大值逐漸下降，但每批傳代液滴里的微生物均能生長，并且隨著進(jìn)化進(jìn)行，液滴間OD逐漸呈現(xiàn)出差異變化。該實(shí)驗(yàn)過程充分體現(xiàn)了適應(yīng)性進(jìn)化的基本實(shí)驗(yàn)策略，即在長期的傳代培養(yǎng)過程中，通過逐漸提高耐受性因子水平，以進(jìn)化出菌種的耐受性。由于MMC的液滴培養(yǎng)單元僅為2 μL，試劑消耗量極少，而進(jìn)樣瓶可以一次性盛放12 mL的樣品，因此單次上機(jī)操作能夠滿足多達(dá)150次的連續(xù)傳代培養(yǎng)。同時(shí)，如圖13B所示，MMC中的每個(gè)液滴代表獨(dú)立進(jìn)化培養(yǎng)單元，MMC的在線檢測功能可以為微生物進(jìn)化培養(yǎng)過程提供海量數(shù)據(jù)，因此結(jié)合MMC的底物和代謝產(chǎn)物檢測功能及后續(xù)多組學(xué)分析方法，能夠?qū)ξ⑸镞M(jìn)化過程進(jìn)行系統(tǒng)深入的分析。
3.6.3 單因素多水平實(shí)驗(yàn)
單因素多水平實(shí)驗(yàn)是在常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)中，用以測定某個(gè)化學(xué)因子對(duì)微生物生長狀態(tài)的影響。本實(shí)驗(yàn)中以單硫酸卡那霉素作為化學(xué)因子，研究其對(duì)大腸桿菌生長的影響。樣品上機(jī)后，選 取軟件中“單因素多水平功能”，設(shè)置參數(shù)為：梯 度個(gè)數(shù)8，每個(gè)梯度平行單元 (液滴) 數(shù)10個(gè)，啟動(dòng)設(shè)備運(yùn)行功能即可。結(jié)果如圖13C所示：圖中不同顏色曲線代表不同的單硫酸卡納霉素培養(yǎng)條件下大腸桿菌生長情況，每條曲線都是根據(jù)在單個(gè)梯度下，對(duì)10個(gè)平行微液滴單元的OD檢測值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理得到的結(jié)果。從圖中可以看出，隨著單硫酸卡納霉素的濃度增加，大腸桿菌的生長受抑制情況越來越嚴(yán)重。相對(duì)于傳統(tǒng)在線檢測設(shè)備，MMC的OD檢測線性范圍寬 (0–20)，可以將微生物生長過程完整地記錄下來，能夠更加便捷地研究化學(xué)因子對(duì)菌種生長的影響規(guī)律。
圖13 MMC在大腸桿菌培養(yǎng)中的應(yīng)用 (A：生長曲線測定；B：以氯化鈉為進(jìn)化壓力的菌株適應(yīng)性進(jìn)化；C：單硫酸卡那霉素對(duì)大腸桿菌生長的單因素多水平影響實(shí)驗(yàn)；D：MMC中菌株代謝檢測 (GFP熒光檢測))
Fig. 13 Use of MMC in E. coli culture. (A) Growth curve test. (B) Adaptive laboratory evolution experiment using NaCl as the selective pressure. (C) Single-factor experiment for bacterial growth with addition of kanamycin monosulfate at different concentrations. (D) Online monitoring of bacterial metabolism in terms of GFP fluorescence during the cell growth in MMC.
3.6.4 微生物代謝水平研究
微生物代謝水平?？梢酝ㄟ^熒光信號(hào)來檢測表征，本研究利用的大腸桿菌含有GFP基因，其熒光信號(hào)強(qiáng)度變化可反映微生物的代謝狀態(tài)變化。選取MMC軟件中“熒光檢測”功能模塊，設(shè)置熒光激發(fā)與檢測波段為 (485ex/528em，即激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長528 nm)，液滴數(shù)目為10，結(jié)果如圖13D所示。圖中的黑色曲線代表大腸桿菌OD值變化，綠色曲線是GFP熒光值變化。從圖13D可以看出，隨著大腸桿菌的生長，其GFP熒光信號(hào)強(qiáng)度也在逐漸增加，表明GFP的合成與細(xì)胞生長偶聯(lián)，而培養(yǎng)到達(dá)平臺(tái)期后，GFP熒光強(qiáng)度基本保持不變，表明蛋白合成結(jié)束。MMC這種在線快速檢測熒光的方式，結(jié)合微生物生長曲線的在線檢測和進(jìn)化培養(yǎng)及分選功能等，對(duì)于能夠合成自身具有熒光的代謝產(chǎn)物的微生物及以熒光蛋白作為分子標(biāo)記的基因工程菌的代謝特性研究具有平臺(tái)支撐作用。
除了上述4種典型的微生物實(shí)驗(yàn)和微生物篩選外，MMC還可以根據(jù)使用者的自身需求，支持自定義編程多種功能，設(shè)置不同的液滴操作流程，以滿足各種實(shí)驗(yàn)需要[17]。同時(shí)，已有的研究結(jié)果也表明，MMC可應(yīng)用于多種微生物的培養(yǎng)研究，表現(xiàn)出明顯優(yōu)于孔板的應(yīng)用成效，具有廣譜適用性[18]。
液滴微流控技術(shù)因生成的液滴體積小、通量高、質(zhì)能交換快、可獨(dú)立操作等特性為微生物研究提供了新方法，但其操作要求高、影響因素多、缺乏自動(dòng)化集成等問題限制了該技術(shù)的應(yīng)用推廣。本研究針對(duì)上述關(guān)鍵難題，通過設(shè)計(jì)開發(fā)液滴識(shí)別功能模塊、液滴檢測模塊、進(jìn)樣模塊以及芯片模塊等，將液滴的發(fā)生、培養(yǎng)、檢測、分割、融合、分選等多種復(fù)雜操作進(jìn)行有機(jī)集成，成功研制出了一款全自動(dòng)高通量微生物微液滴培養(yǎng)系統(tǒng) (MMC)，形成了小型化、自動(dòng)化、高通量的微生物培養(yǎng)系統(tǒng)，并且操作簡單，運(yùn)行穩(wěn)定。相比于傳統(tǒng)的微生物高通量培養(yǎng)裝備，MMC具有物料消耗少、操作簡單、在線檢測 (OD和熒光)、數(shù)據(jù)采集密度大、普適性強(qiáng)等多種優(yōu)勢。
目前，本研究已經(jīng)完成了MMC系統(tǒng)底層單元操作的開發(fā)，未來需要針對(duì)微生物研究的不同需求，進(jìn)一步豐富MMC系統(tǒng)應(yīng)用功能，例如開發(fā)多因素多水平正交實(shí)驗(yàn)功能，多樣品自動(dòng)進(jìn)樣技術(shù)用以同時(shí)測定多個(gè)菌種的生長曲線，液滴內(nèi)氧分壓和pH等參數(shù)的精確控制等，全面助推微生物培養(yǎng)進(jìn)入高通量智能化的微滴時(shí)代。
通訊作者1
主持國家自然科學(xué)基金重大儀器專項(xiàng)項(xiàng)目、中以國際合作項(xiàng)目。發(fā)表學(xué)術(shù)論文280余篇，合作著書8本，編寫英文專著1部，譯著教材2部。申請(qǐng)發(fā)明專利100余項(xiàng)，獲得發(fā)明專利80余項(xiàng)。擔(dān)任Biochemical Engineering Journal副主編及《生物工程學(xué)報(bào)》等多個(gè)國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊編委。獲得第17屆全國發(fā)明展覽會(huì)獎(jiǎng)銀獎(jiǎng) (2007)、北京市科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)三等獎(jiǎng) (2008)、中國石油和化學(xué)工業(yè)協(xié)會(huì)技術(shù)發(fā)明獎(jiǎng)二等獎(jiǎng) (2009)、中國僑界貢獻(xiàn)獎(jiǎng) (創(chuàng)新人才) (2010)、高等學(xué)?？茖W(xué)研究優(yōu)秀成果獎(jiǎng) (科學(xué)技術(shù)) 科技進(jìn)步獎(jiǎng) 二等獎(jiǎng) (2015年)、 第45屆日內(nèi)瓦國際發(fā)明展金獎(jiǎng) (2017)、中國化工學(xué)會(huì)系統(tǒng)2012–2017年度先進(jìn)個(gè)人 (2017)、全國歸僑僑眷先進(jìn)個(gè)人 (2018)、日本東京大學(xué)工學(xué)院會(huì)士 (Fellow) 榮譽(yù)稱號(hào) (2018) 中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)技術(shù)發(fā)明一等獎(jiǎng) (2019)。
通訊作者2
主持國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題。在Nature Chemical Biology、Nucleic Acids Research、Metabolic Engineering等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表多篇論文。擔(dān)任中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)微生物育種分會(huì)秘書長、Carbon Resources、Food Science and Human Wellness等期刊編委。獲得中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)技術(shù)發(fā)明一等獎(jiǎng) (2019)、“長江學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”青年學(xué)者 (2018)、“倫世儀教育基金”杰出青年學(xué)者獎(jiǎng) (2018)、第45屆日內(nèi)瓦國際發(fā)明展金獎(jiǎng) (2017)。
·END·
